西維來司鈉對ANP肺損傷保護作用及其機制研究

丁云麗 吳晶 張愛其★ 徐佳

西維來司鈉對ANP肺損傷保護作用及其機制研究

丁云麗 吳晶 張愛其★ 徐佳

目的 探討西維來司鈉對SD大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的保護作用。方法 健康成年SD 大鼠45 只隨機分成3 組：對照組、模型組、藥物組，每組15只。腹腔注射5%牛磺膽酸鈉建立SAP模型。藥物組在模型基礎上給予西維來司鈉干預，對照組和模型組給予等量生理鹽水。檢測各組在6h、12h、24h時點血清測淀粉酶，動脈血氧分壓，肺組織丙二醛（MDA），腫瘤壞死因子（TNF），髓過氧化物酶（MPO）和中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的含量，光鏡下觀察胰腺和肺的病理變化。結果 同期胰腺、肺病理改變ONO治療組比ANP組明顯減輕，且PaO2均高于ANP組，血清淀粉酶均低于ANP組。大鼠肺組織的NE、MDA、MPO水平隨著制模時間的延長而升高，ONO治療組與ANP組相比較，肺組織MDA、MPO和NE水平均較低。結論 西維來司鈉能明顯抑制ANP肺損傷大鼠促炎細胞因子的釋放和表達，起到對急性胰腺炎肺損傷進行保護作用。

西維來司鈉 急性壞死性胰腺炎 急性肺損傷

急性壞死性胰腺炎（ANP）是臨床上常見的危重疾病，容易并發多器官功能障礙綜合征（MODS），其中肺臟是最常受累的胰外器官，肺損傷是重癥急性胰腺炎（SAP）患者早期病死的主要原因之一［1～3］。西維來司鈉（ONO）是一種特異性中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，可在炎癥局部有效抑制中性粒細胞彈性蛋白酶（NE），減輕肺組織損傷并改善肺功能［4］。作者通過建立大鼠急性壞死性胰腺炎（ANP）肺損傷模型［5］，并應用西維來司鈉對大鼠ANP合并肺損傷進行干預處理，以探討其對ANP合并肺損傷的保護作用及其作用機制。

1　 材料與方法

1.1 動物分組及試劑 購自上海實驗動物中心的雄性SD大鼠45只，體質量220-250g。按隨機法均分為正常組、ANP組和ONO治療組，每組15只。西維來司鈉購和?；悄懰徕c購自美國Sigma公司，使用前用生理鹽水溶解稀釋。MDA和NE檢測試劑盒以及TNF-α和MPO 檢測試劑盒購于北京紫衫生物技術有限公司。

1.2 建立模型 5%?；悄懰徕c（美國Sigma公司）0.2ml/100g體重的方法腹腔注射制備ANP模型，從胰頭部開始，胰腺開始變紅、水腫，面積逐漸擴大。正常組大鼠腹腔內注入等容積生理鹽水。ONO治療組于造模后立即經尾靜脈注射西維來司鈉（12mg/kg）體重，其他兩組注射等容積生理鹽水。

1.3 收集標本并記錄 各組分別于6h、12h及24h時間點取腹主動脈血（肝素抗凝）5ml立即送實驗室檢測動脈血氧分壓，大鼠處死后留取肺組織，檢測MPO、TNF、NE。取胰腺組織和肺組織用10%中性磷酸緩沖福爾馬林液體固定，并進行石蠟包埋，連續切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后留實驗室光鏡觀察。

1.4 標本檢測 血清淀粉酶檢測采用全自動生化分析儀，肺組織檢測NE、MDA、MPO和TNF采用酶聯免疫吸附試驗。ELISA，PaO2檢測采用全自動血氣分析儀。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析。各組數據資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組間分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　 結果

2.1 TNF、MDA 、NE、血清淀粉酶、MPO 、PaO2的變化 ANP組TNF-α水平在對應時間點水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。血漿淀粉酶、MPO、NE、MDA水平的變化SAP組各時間點均較正常組升高，差異有統計學意義（P＜0.05），ONO治療組MPO、血漿淀粉酶、MDA、NE水平均較SAP組降低（P＜0.05）。ANP組PaO2各時間點較正常組組和治療組均降低（P＜0.05）。

2.2 胰腺和肺組織病理學改變 正常組胰腺組織和肺組織未見明顯異常，無水腫、出血。ANP組大鼠可見胰腺、肺泡及肺間質明顯水腫充血，肺泡壁破壞，大量滲出，間質炎性細胞浸潤，胰腺組織間隙明顯增寬，腺泡細胞明顯水腫及腺泡結構破壞并可見大量的炎性細胞浸潤，可見胰腺細胞壞死，胰腺周圍組織器官輕度粘連，并可見散在皂化斑， ONO治療組與ANP組相比，胰腺病理改變均較輕，病理評分下降，病理評分與同時間點ANP組的差別有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠各時點TNF、MDA 、NE、淀粉酶、MPO、 PaO2的變化

圖2 大鼠胰腺組織、肺組織病理改變

3　 討論

很多研究表明， 蛋白酶在ALI 、ARDS 的發病過程中起重要作用［4］。多形核粒細胞和單核、巨噬細胞溶酶體中的絲氨酸蛋白酶（彈性蛋白酶等），在病理過程中， 中性粒細胞釋放的彈性蛋白酶最為重要， 不僅數量多， 而且在中性環境中對補體、免疫球蛋白、轉運蛋白、各種抗蛋白酶及凝血、纖維蛋白溶解系統均有破壞作用［5］。彈性蛋白酶也可破壞人體主要半胱氨酸蛋白酶拮抗藥cystatin C 和激肽原， 加重單核 巨噬細胞生成釋放的半胱氨酸蛋白酶對機體的破壞作用。中性粒細胞彈性蛋白酶還能分解滅活凝血、纖溶和補體連鎖系統中一些主要蛋白酶抑制藥如抗凝血酶Ⅲ 、纖維蛋白單體溶酶原抑制藥和補體C1 抑制藥， 引起大量凝血因子的消耗和炎癥細胞趨化因子的形成［6］。

在體外動物實驗中， 彈性蛋白酶能增強肺血管內皮細胞及肺泡上皮細胞通透性， 經大鼠氣管給予彈性蛋白酶可引起出血性肺損傷。而且在用各種方法引起的大鼠肺損傷模型中， 都出現肺泡內出血及蛋白滲出，肺血管周圍水腫及血管通透性增強等病理改變， 表現為肺間質及肺泡性肺水腫癥狀， 同時發現這些動物支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid ， BALF）及血漿中的彈性蛋白酶活性明顯增高［7］。彈性蛋白酶有分解蛋白質的活性， 損傷肺血管內皮細胞、肺泡上皮細胞及血管基膜， 促使血液成分的滲出， 出現肺泡內出血，肺間質及肺泡性水腫等病理反應［8］。

西維來司鈉是彈性蛋白酶的選擇性抑制藥， 對于各種實驗性肺損傷模型均有效。在靜脈給予內毒素引起的ALI 模型中， 持續給予西維來司鈉， 能抑制肺水腫及肺泡中性粒細胞浸潤， 改善呼吸功能，在博來霉素造成小鼠肺纖維化的模型中［9］。皮下注射該藥能夠抑制肺纖維化， 西維來司鈉能選擇性抑制彈性蛋白酶， 不僅在體外能抑制彈性蛋白酶引起的肺血管內皮細胞對蛋白通透性的增高， 而且靜脈滴注能抑制彈性蛋白酶引起的大鼠的出血性肺損傷［10］。

本研究通過腹腔注射牛黃膽酸鈉建立大鼠SAP 肺損傷模型，在建模后立即給予西維來司鈉干預SAP 大鼠，通過觀察肺組織中性粒細胞的活性和肺水腫的程度以及胰腺病理變化來綜合評價損傷程度。本研究發現：ANP組TNF水平在對應時間點水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。血漿淀粉酶、MPO、NE、MDA水平的變化SAP組各時間點均較正常組升高，差異有統計學意義（P＜0.05），ONO治療組MPO、血漿淀粉酶、MDA、NE水平均較SAP組降低（P＜0.05）。ANP組PaO2各時間點較正常組組和治療組均降低（P＜0.05）。

綜上所述， 西維來司鈉對減輕大鼠急性胰腺炎肺損傷是有效的，主要是通過減少中性粒細胞在肺內的聚集起到緩解肺損傷的作用。我們將在今后的研究中繼續探索西維來司鈉在胰腺炎中的作用機制，為今后在臨床上應用西維來司鈉治療急性胰腺炎肺損傷提供實驗參考依據。

1 Yamada K， Kobayashi H， Bo R ，et al. Elevation of pivaloylcarnitine by sivelestat sodium in two children. Molecular genetics and metabolism，2015， 116（3）：192～194.

2 梁啟新.清胰湯對輕癥急性胰腺炎的臨床療效及對炎癥因子的影響.浙江臨床醫學，2014，7（8）：1226～1227.

3 Wang Y， Yang H， Hu Q ，et al. ［Effects of sivelestat on acute lung injury in dogs with severe burn-blast combined injury］. Zhonghua shao shang za zhi = Zhonghua shaoshang zazhi = Chinese journal of burns， 2014，30（2）：158～165.

4 趙群，江濤，張宗兵，等. 脂氧素A4對重癥急性胰腺炎肺損傷小鼠的保護作用. 中華全科醫學，2015，2（7）：190～193.

5 符洋.加貝酯聯合奧曲肽治療重癥急性胰腺炎療效觀察.浙江臨床醫學，2014，8（2）：225～226.

6 Sakai S， Tajima H， Miyashita T ，et al. Sivelestat sodium hydrate inhibits neutrophil migration to the vessel wall and suppresses hepatic ischemiareperfusion injury. Digestive diseases and sciences， 2014， 59（4）：787～794.

7 Park JS， Park KH， Kim H ，et al. Effects of sivelestat treatment on acute lung injury in paraquat-intoxicated rats. Drug and chemical toxicology，2014， 37（1）：114～120.

8 石占利，李國輝，孫靜，等. 大黃素對重癥急性胰腺炎并發急性肺損傷大鼠的干預作用. 中華危重癥醫學雜志，2015，3（2）：143～149.

9 Miyoshi S， Ito R， Katayama H ，et al. Combination therapy with sivelestat and recombinant human soluble thrombomodulin for ARDS and DIC patients. Drug design， development and therapy， 2014， 8：1211～1219.

10 Nagai Y， Watanabe M， Baba Y ，et al. Preventive effect of sivelestat on postoperative respiratory disorders after thoracic esophagectomy. Surgery today， 2013， 43（4）：361～366.

Objective To study the protective effect of sivelestat against acute necrotizing pancreatitis associated lung injury in SD rats. Methods 45 healthy adult SD rats randomly divided into 3 groups： control group， model group， medication group， each group of 15 only. Retrograde injection of 5% sodium taurocholic acid pancreatic and SAP model was established. Drug groups on the basis of model sivelestat intervention， control group and model group was given amount of saline solution. Detection between groups at 6 h， 12 h， 24 h point measuring serum amylase， arterial blood oxygen partial pressure， lung tissue malondialdehyde （MDA）， tumor necrosis factor （TNF alpha），myeloperoxidase （MPO） and neutrophil elastase （NE） content， then observe the pathological changes of pancreas and lung. Results The histologieal injury of pancreas and lungs was milder than ANP group. PaO2was higher than ANP group， serum amylase were lower than that of ANP group.NE of rat lung tissue， MDA， MPO level as the molding time increases， with the extension of ONO， the treatment group compared with ANP group， the level of MDA， MPO and NE lung tissue is low. Conclusions Treatment with Sivelestat sodium effectively inhibits the release and expression of proinfl ammatory cytokine in ANP lung injury of rats and relieved lung pathological injuries.

Sivelestat sodium Acute necrotizing pancreatitis Acute lung injury

322000 溫州醫科大學附屬義烏醫院普外科（丁云麗吳晶 徐佳）310005 浙江中醫藥大學附屬中山醫院普外科（張愛其）
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