細胞代謝組學用于輻照干預肺癌細胞A549的機制研究

鄭慶輝

細胞代謝組學用于輻照干預肺癌細胞A549的機制研究

鄭慶輝

目的 研究電離輻射抑制肺癌細胞系A549細胞的作用機制。方法 應用核磁共振氫譜的代謝組學方法，分析輻照后A549細胞系和正常A549細胞系的變化。結果 經分析得到乳酸、甘油、丙氨酸、葡萄糖、甘氨酸、肌酸、磷酸肌酸、 UDP-葡萄糖、ATP等9種代謝差異物。結論 電離輻照主要通過抑制DNA合成和底物磷酸化生成ATP反應來抑制A549細胞的增殖。從細胞代謝組學角度為放療的殺傷機制提供新的認識。

電離輻射 細胞代謝組學 增殖 抑制

放射治療是利用一種或多種電離輻射對惡性腫瘤及一些良性病進行治療，然而放射治療腫瘤屬于隨機性殺傷，其主要通過產生自由基的方式作用于腫瘤細胞周期，從而起到殺傷作用［1］。本文通過細胞代謝水平分析，在小分子代謝物變化基礎上，探討放療殺傷細胞的機制。

1　 材料和方法

1.1 儀器與試劑 AVANCE III 600 MHz核磁共振譜儀（Bruker公司），生物學X-ray輻照儀（Rad Source），Concentrator plus濃 縮 儀（Eppendorf）， 真空冷凍干燥機（中國 北京博醫康實驗儀器），培養箱（Thermo Fisher Scientific），SORVALL ST16R離 心 機（Thermo Fisher Scientific）。Gibco RPMI-1640干粉（Life Technologies），HyClone胎牛血清（Thermo Scientific），甲醇（天津科密歐），氯仿（天津科密歐），氘代水（Cambridge Isotope Laboratories）。

1.2 細胞培養 在完全RPMI-1640培養液 （含10%胎牛血清 + 1%雙抗） 中培養肺癌細胞系A549。經亞致死量 （18 Gy） X線輻照后（處理組）傳代至25cm2培養瓶中，37℃ 5% CO2培養箱中培養48h，未處理的A549細胞在相同條件下培養作為對照組。

1.3 細胞內代謝物樣品收集 取生長適宜的細胞，倒掉培養基，冰磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，4℃，PBS）洗2遍。加入2ml-20℃預冷的甲醇。使用細胞刮刀刮下細胞。將甲醇中淬滅的細胞移至15ml離心管中，加入2 ml-20℃預冷的氯仿和冰上預冷的純水 （體積比1：1：0.7）。渦旋5min混勻后靜置15min，4℃，12000r/min離心30min，形成兩相萃取液［2，3］，保留其中水相用于NMR分析。真空凍干機將樣品凍干后進行NMR檢測。用450μl氘代水+50μl緩沖液 （1.5M磷酸氫二鉀 + 0.375 M磷酸二氫鈉，pH 7.4，含0.1%TSP、0.2%疊氮鈉） 溶解樣品［4］。渦旋混勻后4℃，12000r/ min離心5min去除不溶物。將上清液移至5mm核磁管待測。

1.4 1H核磁波譜采集條件 使用Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振譜儀在298.15K溫度下檢測。壓制水峰脈沖序列noesypr1d （［RD-90°-t1-90°-tM-90°-ACQ］） 檢測樣品。弛豫延遲設為3s，t1設為4μs，混合時間tM設為120ms，采樣時間為1.64s。在TOPSPIN軟件中采集256次自由感應衰減（FIDs），保留32k數據點，充零至64k，譜寬為10 kHz。所有FIDs乘以線寬1 Hz的指數函數加窗，經傅里葉變換，得到波譜信號數據。

1.5 波譜數據預處理 在MestReNova軟件中調整所有NMR譜的相位和基線，將TSP峰設置為0 ppm，以0.002 ppm為區間計算分段積分 （bin） 后導出為文本。在自編MATLAB腳本中進行數據預處理。保留0.6～9.5 ppm的數據點，將水峰 （4.5～5.2ppm） 區間移除。每個譜均保留4500個bins。經過概率商歸一化 （PQN） 處理，根據參照譜計算各樣品的稀釋因子，減少樣品濃度不同導致的差異［5］。統計全相關譜根據預處理后的數據繪制二維譜，顯示各化學位移之間的相關關系［6］。相關系數r的閾值根據Bonferroni校正P值和變量數計算，降低假陽性的概率。

2　 結果

2.11HNMR譜與模式識別分析顯示輻照處理的A549代謝特征 通過Chenomx NMR Suite軟件，結合統計全相關譜 （STOCSY） 確定譜中主要的代謝物，化學位移和相應歸屬的基團（見表1）。數據首先經過主成分分析 （PCA）比較，顯示樣品在主成分空間中的分布。得分圖中可見輻照后的A549細胞和未處理A549細胞在第一主成分上 （PC1） 能夠區分，輻照后的A549細胞的代謝特征與未照射細胞相比存在差異（見圖1A）。然后使用有監督的模式識別算法進行分析，首先用偏最小二乘判別分析建模，得分圖中能在第一主成分上能夠區分輻照與未輻照細胞（見圖1B）。經過400次交叉驗證，模型無過擬合現象，數據預測能力好（見圖1C）。在PLS-DA模型可靠的基礎上，通過旋轉主成分投影濾去無關信息，建立OPLS-DA模型，使兩組樣品在預測主成分上得到最大區分（見圖1D），通過各變量的VIP、相關系數r和荷載值loading篩選區分兩組樣品的差異代謝物。根據VIP和相關系數r繪制荷載圖并顯示差異物質的變化方向 （見圖1E）。其中：丙氨酸（Alanine）、葡萄糖（Glu）、甘氨酸（Glycine）、牛磺酸（Taurine）、肌酸（CR）、磷酸肌酸（CP）、UDP-葡萄糖、ATP在輻照后細胞內含量降低，乳酸（Lactate）、乙二醇（Ethylene glycol）、甘油（Glycerol）在輻照后細胞內含量升高。

表1 化學位移和相應歸屬的基團

圖1 多變量分析圖和載荷圖

2.2 細胞內代謝物改變 單變量分析輻照后細胞內升高的物質包括乳酸（Lactate）、甘油（Glycerol），降低的物質有丙氨酸（Alanine）、葡萄糖（Glu）、甘氨酸（Glycine）、肌酸Creatine （CR）、磷酸肌酸（Creatine Phosphate CP）、 UDP-葡萄糖、ATP，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

3　 討論

放療主要通過電離輻射的能量產生自由基和活性氧reactive oxygen species （ROS），對處于M期和G2期的細胞造成DNA損傷，造成G2/M期阻滯，使細胞停止生長，誘導其凋亡，從而達到殺傷腫瘤的作用［13～16］。甘氨酸可經甘氨酸羥甲基轉移酶催化與5，10-亞甲基四氫葉酸反應，生成絲氨酸和四氫葉酸，后者是DNA合成過程中重要的輔酶。本資料中甘氨酸在輻照處理的A549細胞中降低，提示A549甘氨酸合成四氫葉酸減少，進而導致DNA合成功能受損，最終使細胞增殖能力減弱。

本文輻照后的A549細胞中，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量降低結合生物信息學分析提示AST、ALT、AGT 三個氨基轉移酶［17］在輻照后其活性降低，DNA合成活性降低。同時磷脂酰膽堿 （PC）是生成細胞膜的重要原料之一，其降低也提示細胞膜合成能力降低，最終影響細胞增殖能力。

ATP作為細胞直接的供能物質，在輻照后含量降低，提示輻照后的A549細胞通過底物水平磷酸化合成ATP的能力減弱，細胞直接供能障礙導致細胞生長緩慢。同時乳酸在輻照后的A549細胞中增多，提示細胞進行大量的無氧呼吸供能，降低供能效率，從側面反應細胞的供能障礙。

本資料中，在A549細胞中發現一系列輻照后改變的代謝物，進一步分析發現，輻照后的A549細胞DNA合成障礙，導致細胞增殖能力減弱，同時輻照后的A549細胞有氧呼吸減弱，導致ATP生成減少，影響細胞的正常生長。基于核磁共振的代謝組學能夠用于尋找細胞經過輻射處理后受到干擾的關鍵代謝物，尋找不同腫瘤放療的具體機制，為進一步放療研究提供新的方法和思路，為個體化治療提供技術支撐和理論依據，有很好的應用前景。

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Objective To explore the mechanism of ionizing radiation's inhibitary effects on the lung carcinoma A549 cell line. Methods The metabolome of nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum was applied to analyze the change of A549 cell line. Results The product of metabolism were obtaine，ie. lactic acid， glycerin， anlanine，glucose， glycine， creatine， creatine phosphate， UDP-glucose and ATP. Conclusions The ionizing radiation suppressed the proliferation of A549 cell by suppressing the DNA synthesis and ATP producing through substrate phosphorylation， which provides a novel mechanism for radiotherapy from the angle of cellular metabolome.

Ionizing radiation Cellular metabolome Proliferation Inhibit

530000 廣西醫科大學

1.6 模式識別分析 在SIMCA-P+軟件 （Ver. 12.0，Umetrics，Ume?，Sweden） 中導入預處理后的數據進行模式識別分析和多變量分析。數據經過Pareto變換減少樣品中不同物質濃度差異造成的變異［7］。首先用一種非監督模式識別方法-主成分分析 （PCA） 對數據做降維處理，得到數據的預覽［8］。之后用偏最小二乘判別分析 （PLS-DA），一種有監督的模式識別方法，將分組做為響應變量Y進行建模，將使輻照樣品和未處理樣品得到最大區分。軟件計算得到模型的Q2 和R2分別用于評價模型的擬合程度和預測能力。經過400次7-fold交叉驗證，避免出現過擬合［9～11］。通過驗證的模型經正交偏最小方差判別分析 （OPLS-DA）算法建模，濾去無關噪聲同時使兩組數據在得分圖上能夠最大區分［12］。導出模型的相關系數和變量重要性投影 （VIP） 以及荷載值，回溯變換后繪制荷載圖并對差異代謝物進行鑒定和指認。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 6軟件。計量資料用（±s）表示，用t檢驗。對模式識別篩選出的差異物質和其它譜圖中指認出的物質進行單變量分析。P＜0.05為差異有統計學意義。