ERCP治療ABP細胞因子及小腸黏膜COX-2蛋白研究

張樂 韓娟 范震★

ERCP治療ABP細胞因子及小腸黏膜COX-2蛋白研究

張樂 韓娟 范震★

目的 探討經內鏡逆行性胰膽管造影術（ERCP）介入治療對急性膽源性胰腺炎（ABP）患者血清細胞因子及小腸黏膜環氧化酶-2（COX-2）蛋白表達的影響作用及其相關性。方法 根據有無器官功能障礙或局部并發癥、Ranson評分＜或≥3分、CT 分級分為輕癥急性胰腺炎（MAP）和重癥急性胰腺炎（SAP）兩組。分別提取兩組ERCP術前及術后1周患者血液及小腸黏膜組織，應用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）及免疫組化技術分別檢測血清細胞因子IL-6及十二指腸黏膜COX-2蛋白表達。結果 30例ABP患者，經ERCP內鏡治療后，術后1周較術前生化指標明顯改善（P＜0.01）；兩組30例ABP患者，血清IL-6表達SAP組明顯高于MAP組（P＜0.01），經ERCP內鏡治療術后1周較術前患者血清IL-6表達明顯降低 （P＜0.05） ；兩組30例ABP患者，術前十二指腸黏膜COX-2蛋白表達SAP組明顯高于MAP組（P＜0.05），經ERCP內鏡治療術后1周較術前COX-2蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。結論 ABP患者經ERCP介入治療后臨床表現及生化指標明顯改善。ABP患者重癥者較輕癥者血清IL-6及小腸黏膜COX-2蛋白高表達，經ERCP介入治療術后血清IL-6及小腸黏膜COX-2蛋白表達降低。

ERCP 急性膽源性胰腺炎 白介素-6 環氧化酶-2

經內鏡逆行性胰膽管造影術（ERCP）已成為急性膽源性胰腺炎（ABP）的一種重要治療手段。在AP發病中所起的作用中，“細胞因子學說”已占有重要地位。其中血清IL-6在短期內可達峰值，其高峰出現時間和濃度可作為早期識別AP病情輕重的有效指標。另有報道認為，在AP的進展和嚴重程度方面COX-2是一個關鍵的早期炎癥介質和早期反應基因模式。 COX-2作用于胰腺的可能機制為：促進胰酶的分泌；影響胰腺血流和誘發胰腺微循環障礙；促進胰腺血管內皮炎癥；水解生物膜，破壞線粒體和溶酶體。

1　 臨床資料

1.1 一般資料 2014年12月至2015年2月期間確診ABP的住院患者30例，男14例，女16例，年齡38～85歲，平均（62.0±15.0）歲。合并高血壓病10例、糖尿病11例、 冠心病6例。

1.2 ABP患者臨床分型及評判標準 臨床胰腺分型可分為輕癥胰腺炎和重癥胰腺炎，通過Ranson積分［1］和影像學上的CT分級來綜合評判予以分型。Ranson積分＞3分即為重癥急性胰腺炎。CT分級∶A～C級：臨床上為輕癥急性胰腺炎；D～E級：為重癥急性胰腺炎。綜合上述評判標準，30例ABP患者分為輕癥急性胰腺炎（MAP）22例，重癥急性胰腺炎（SAP）8例。

2　 結果

2.1 ERCP內鏡治療及療效 30例ABP患者經內鏡插管行ERCP治療均成功，成功率100%（30/30），常規留置鼻膽管引流（ERCP+EST+ENBD），其中行EPBD 者5例。ERCP術后2例（40%）患者并發術后一過性高淀粉酶血癥，3例（10%）患者術后腹痛加重，考慮EST所致，術后無出血、穿孔及死亡患者。ERCP術后1周與術前比較患者腹痛、黃疸及肝功能明顯改善（P＜0.01）；ERCP術后1周血清淀粉酶較ERCP術前水平明顯降低（P=0.001）。見表1。

表1 ERCP治療前后肝功能指標［n=30，（±s）］

表1 ERCP治療前后肝功能指標［n=30，（±s）］

ALT（U/L）　AST（U/L）　GGT（U/L）　B-AMS（U/L）　GLU（mmol/L）　TBIL（μmol/L）　DBIL（μmol/L）術前　204.6±151.57　114.43±104.79　295.64±198.27　302.30±102.30　9.49±4.71　160.70±100.4　114.25±91.30術后　76.50±62.0　40.14±26.78　156.50±116.62　20.41±11.32　5.01±2.61　98.27±92.40　67.23±58.17 P值　0.000　0.002　0.001　0.001　0.000　0.014　0.015

2.2 ABP患者ERCP介入治療前后血清IL-6表達 30例ABP患者重癥組血清IL-6表達明顯高于輕癥組，差異有統計學意義 （P＜0.05），30例ABP患者兩組經ERCP治療術后1周較術前血清IL-6表達均明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 ERCP治療前后兩組患者血清IL-6濃度變化比較（pg/ml）

2.3 ABP患者ERCP介入治療前后小腸黏膜COX-2表達及內鏡下觀察 30例ABP患者重癥組小腸黏膜COX-2表達陽性率明顯高于輕癥組，差異有統計學意義 （P＜0.05），兩組經ERCP治療術后1周較術前明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。30例ABP患者內鏡下小腸黏膜明顯充血水腫，伴有不同程度的糜爛和潰瘍 見表3。

表3 ERCP治療前后兩組患者COX-2表達陽性率［n（%）］

3　 討論

3.1 膽源性胰腺炎內鏡介入治療 目前，關于ABP的治療策略主要有三種：內科保守治療、外科手術治療及內鏡介入治療［2］。多項研究表明ABP早期不適宜外科手術，因手術創傷大，感染率高，臟器應激性損傷大。因此內科保守治療及內鏡治療成為臨床上的主要選擇。一些專家［3］認為，內科經積極解痙與抗感染治療，能夠有效緩解膽管壁黏膜的水腫情況，小結石會排入十二指腸，大結石則會浮起，膽道梗阻可能解除。對于ABP，無論是梗阻型還是非梗阻型，均應先行非手術治療，先緩解癥狀，為手術創造有利條件，主張延期手術。另一些專家主張早期內鏡介入治療，通過ERCP+EST+ENBD等取石的方法，可以從根本上去除病因，解除或降低膽道、胰管內壓力、通暢胰液引流，避免胰腺炎輕癥型向重癥型發展，且ERCP內鏡介入治療具有創傷小、對機體內環境影響較小，手術時間短等優點，避免外科手術可能導致的并發癥，降低手術風險 。

研究［4］表明，與傳統治療方案比較，內鏡早期聯合內科治療對ABP患者的主觀癥狀、體征、生化指標、內毒素血癥、TNF-α、IL-10、CD4+/CD8+、CT分級改善明顯，患者住院費用、住院時間均明顯減少，是安全、有效、經濟的治療方案。本資料顯示，30例ABP患者通過ERCP內鏡結合常規內科治療后，腹痛、黃疸等主觀癥狀、體征、生化指標明顯改善（P＜0.01）。30例ABP患者ERCP術后未出現出血、穿孔及死亡。其機制可能為內鏡治療后膽胰管壓力降低，改善胰腺微循環，阻斷細胞因子及炎癥介質的釋放，從而減輕全身炎癥反應進程，減少氧自由基、CO的產生，減少細菌易位，對胰腺細胞起保護作用所致。因此，內鏡治療對ABP有重要的臨床價值。

3.2 血清IL-6的表達和臨床意義 IL-6主要由單核細胞在腫瘤壞死因子（TNF）等誘導下產生，也可由激活的巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞等產生，是一種重要的炎癥始動因子。促炎-抗炎細胞因子學說認為［5，6］，機體受到有害的炎癥刺激后炎癥反應時，機體的保護機制被啟動，釋放促炎因子的同時抗炎機制也被啟動，釋放抗炎細胞因子對炎癥反應進行調節。目前文獻中提出的促炎細胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等，抗炎因子包括IL-4、IL-10、IL-12等。正常情況下，促炎細胞因子和抗炎細胞因子均呈低分泌狀態，并保持平衡，當促炎細胞因子過度釋放，而抗炎細胞因子處于相對劣勢時，機體表現為全身炎癥反應綜合征（SIRS）。因此維持二者動態平衡在治療SAP及防治MAP向SAP 進展中起重要的作用。本資料結果提示，30例ABP患者重癥組血清IL-6表達明顯高于輕癥組（P＜0.05），經ERCP治療術后1周較術前血清IL-6表達均明顯降低 （P＜0.05），并與臨床表現緩解及生化指標改善時間相符。提示血清IL-6表達與炎癥程度密切相關。

3.3 小腸黏膜COX-2蛋白表達和臨床意義 COX-2是前列腺素合成過程中一個主要的限速酶。研究發現，COX-2參與病理條件下的應激反應。COX作為產生PG合成的上游的限速酶，廣泛參與細胞的生理、病理過程，特別在機體炎癥發生過程中具有重要作用。COX-2產物通過增加血管通透性引起組織水腫，對白細胞具有明顯的趨化作用。有報道認為，在AP的進展和嚴重程度方面COX-2是一個關鍵的早期炎癥介質和早期反應基因模式，但其作用機制目前尚不完全明確。有關研究發現，其機制可能與AP時COX-2參與細胞調亡（apoptosis）有關。眾多來自腫瘤及其他疾病的研究結果均表明，COX-2蛋白的過度激活與表達可抑制細胞凋亡。大量動物實驗研究［7］顯示，細胞凋亡與胰腺炎的輕重程度呈負相關。細胞凋亡對胰腺損傷有抑制作用。COX-2與炎癥等病理過程密切相關，正常情況下體內不表達，是一種重要的前炎癥介質。本資料結果顯示，30例ABP患者的十二指腸黏膜組織COX-2蛋白表達陽性率重癥組明顯高于輕癥組（P＜0.05）；經ERCP介入治療術后COX-2 蛋白表達陽性率則明顯降低（P＜0.05）。提示ABP患者發病機制與COX-2高表達密切相關。其作用機制可能為：COX-2高表達導致胰腺血流改變，誘發胰腺及小腸黏膜微循環障礙有關；另外，COX-2高表達還能引起胰腺血管內皮炎癥；水解生物膜，破壞線粒體和溶酶體，從而導致疾病發生。而病情控制后，對應的COX-2表達減少，此與大量動物模型實驗研究結果一致。

1 羅建華.Ranson評分系統在重癥急性胰腺炎中的應用價值.華西醫學，2008，23（ 5） ：1021～1022.

2 吳會軍.膽道結石在膽源性胰腺炎中的處理方式探討.中國醫藥導報，2008，5（6）：121.

3 樊斌，張家耀，張勇，等.急性膽源性胰腺炎的臨床診治分析.臨床研究， 2013， 11（32）：349～350.

4 周文策.ERCP與急性膽源性胰腺炎的臨床研究.蘭州：蘭州大學，2011.

5 Chen CC，Wang SS，Lee FY. Action of antiproteases on the inflammatory response in acute pancreatitis.2007，8（4Suppl） ：488～494.

6 Novovic S.Proinflammatory cytokines in alcohol or gallstone induced acute pancreatitis.2009， 10（ 3） ：256～262.

7 謝榮俊，張樹友，李峰，等.急性胰腺炎時環氧化酶-2表達與腺泡細胞凋亡.中國現代醫學雜志，2012，22（5）：15～18.

Objective To explore the infl uence of endoscopic retrograde cholangio-pancreatography （ERCP） for acute biliary pancreatitis （ABP），and the expression of cytokines and cyclooxygenase-2（COX-2）. Method 1. 30 patients with ABP from September 2012 to September 2013 were observed. According to the presence or absence of organ dysfunction or local complications，Ranson score less than or greater than 3 points，CT graded as A，B，C，D，E，divided 30 cases of patients with ABPinto mild acute pancreatitis（MAP） group and severe acute pancreatitis（SAP）group （22 of MAP，8 of SAP）. 2. By extracting blood and tissue of 30 patients before and 1 week after ERCP，test serum cytokines IL-6 using ELISA，and measure duodenal mucosa COX-2 protein expression by immunohistochemical techniques. Results In 30 cases of patients with ABP，the biochemical indicatorsof group postoperationdecreasedcomparede with group preoperation （P＜0.01） ； in 30 cases of patients with ABP，serum IL-6 expressed lower signifi cantly ingroup postoperationthan in group preoperation （P＜0.01），serum IL-6 expressed lower signifi cantly in group MAP expressed lower signifi cantly than group SAP （ P＜0.05）； in 30 cases of patients with ABP，the COX-2 protein of duodenal mucosa expressed lower significantlyingroup postoperationthan in group preoperation（P＜0.05），the COX-2 protein of duodenal mucosa in group MAP expressed lower signifi cantly than group SAP （P＜0.05）. Conclusion In 30 cases of patients with ABP，by ERCP treatment，the clinical manifestations and biochemical parameters improved signifi cantly； the expression of IL-6 and COX-2 is lower after ERCP treatment.

ERCP Acute biliary pancreatitis Interleukin-6 Cyclooxygenase-2

310053 浙江中醫藥大學
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1.3 操作器材 日本Olympus公司JF-260或TJF240電子十二指腸內鏡及附件，日本全自動生化分析儀，武漢博士德生物公司IL-6 ELISA試劑盒（EK0410），COX-2蛋白單克隆抗體（SA1022）及免疫組化試劑盒（SA1052），自動洗板機，酶標儀，高精度加液器及一次性吸頭，-80℃超低溫冰箱，4℃冰箱，離心機。

1.4 ERCP操作方法 術前所有患者均行MRCP及上腹增強CT以了解梗阻部位及程度。禁食8～12h，常規行ERCP+EST+ENBD手術。EST 術后有利于鉗夾、圈套操作，使膽石等順利排出膽道。乳頭氣囊擴張術（EPBD）的原理是在十二指腸鏡下沿造影管插入斑馬導絲，沿導絲插入氣囊導管達乳頭內，使氣囊中部恰好在乳頭狹窄區，從氣囊導管內注入生理鹽水達5～8×760mmHg，擴張 2～3min，間隙30s后再擴張2min 即可使十二指腸乳頭擴張。ERCP術時經電子十二指腸內鏡，活檢鉗取十二指腸乳頭旁組織1-2塊，置于福爾馬林固定液中保存。術后1周再次行ERCP術，再次鉗取十二指腸乳頭旁組織1-2塊，置于福爾馬林固定液中保存。標本以用于檢測小腸黏膜COX-2蛋白表達。

1.5 ABP患者血清IL-6及十二指腸黏膜COX-2蛋白表達檢測 （1）血清IL-6測定實驗方法：ERCP術前當天清晨及術后7d分別空腹抽取靜脈血，3ml保存于無菌抗凝試管內，3ml保存于無菌無抗凝試管內。抗凝管內血樣即送生化室化驗，檢測肝功能指標：丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、γ-谷氨酰基轉移酶（γ-GT）、血清淀粉酶（B-AMS）、血糖（GLU）。無抗凝管內血樣經離心后（2000r/min，離心10min），取上清液于無菌試管中并置入-80℃冰箱保存，行批量測定IL-6。（2）十二指腸黏膜COX-2測定實驗方法：術前術后標本固定后，制作石蠟切片，行免疫組化學SABC法，按試劑盒說明書操作，COX-2染色的陽性反應為細胞胞膜、胞漿中出現棕黃色顆粒。每張切片在400倍鏡下隨機選取5個視野，根據陽性細胞占視野總細胞數的比例分為4級。陰性：陽性細胞數＜10%；陽性：陽性細胞數≥10%。