補腎活血方對早期激素性股骨頭壞死血液粘滯性基因表達影響的研究

耿艷華 王昌興 石仕元 董黎強 謝文君 趙毅

補腎活血方對早期激素性股骨頭壞死血液粘滯性基因表達影響的研究

耿艷華 王昌興 石仕元 董黎強 謝文君 趙毅

目的 探討補腎活血方對激素性股骨頭壞死大鼠病變早期血液粘滯性基因表達及病理生理改變的影響。方法 成年健康SD大鼠30只，隨機分成實驗組，中藥組以及對照組。實驗組及中藥組先予腹腔注射內毒素20g/kg，間隔24h，分2次注射，然后肌注甲強龍40mg/kg，連續注射3次，間隔24h。造模后中藥組予補腎活血方灌胃，實驗組及對照組均用等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，分別在造模后第3周處死大鼠，取大鼠左側股骨頭洗凈、做矢狀對半分開，一半行石蠟包埋、制備組織病理HE切片，另一半行基因芯片制作、分析及熒光定量PCR檢測。結果 組織病理學檢測顯示骨髓腔未見擴張，營養血管充盈情況良好，血管密度輕度增加。骨小梁間基質未見萎縮、退變，關節軟骨厚度、細胞成熟度、生發層次序及生長板上中藥組均好于實驗組，并接近于正常對照組組織。基因芯片結果顯示，中藥組與實驗組比較，ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A的表達均明顯增高（倍數變化＞2），差異有統計學意義；熒光定量PCR檢測結果顯示，中藥組三種基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A表達均顯著高于實驗組（P＜0.01），差異有統計學意義。結論 激素性股骨頭壞死早期相關血液粘滯性基因表達均出現明顯下調，提示信號傳導分子基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A是早期的SNFH發生、發展過程中起作用的關鍵基因。補腎活血方能有效恢復股骨頭血液粘滯性相關基因表達的改變，促進骨代謝動態平衡恢復，使早期股骨頭病損得以及時修復。

激素性股骨頭壞死 血粘度 SD大鼠 補腎活血 基因表達

激素性股骨頭是壞死是現今臨床骨科常見疾病，目前發病率已超過外傷所致的股骨頭壞死。目前該病的治療方法較多，而中藥治療也是其熱點之一。補腎活血中藥可以促進血供改善和骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，抑制骨髓源性破骨細胞的生長。本實驗用誘導激素性股骨頭壞死模型研究病變初期進行中藥干預情況下，大鼠股骨頭組織病理學以及血粘度相關基因表達變化，進一步探討補腎活血方對激素性股骨頭壞死早期血粘度基因表達調節變化和病理生理改變，為早期治療股骨頭壞死、指導臨床診治以及中醫新藥的研發提供相關理論依據。

1　 材料及方法

1.1 實驗動物分組及造模 健康SD大鼠，體重（200±10）g，30只，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。將上述大鼠隨機分為實驗組，中藥組，對照組各10只，所有大鼠在同一條件下飼養。實驗組予內毒素20g/kg注射，間隔24h，分2次注射，再間隔24h，注射甲強龍40mg/kg，連續注射3次，間隔24h。中藥組前5d處理同實驗組，第6天開始予補腎活血湯灌胃。對照組，連續5d等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，正常飼養。所有大鼠均于第3周處死，使用脊髓脫臼法處死大鼠，沿腹部向下剪開，顯露恥骨聯合，沿矢狀位剪斷恥骨聯合和髖關節剪開關節囊，將股骨頭完整分離出來，并去除其周圍的軟組織，用咬骨鉗沿股骨頸以及股骨粗隆部離斷，取出大鼠左側股骨頭洗凈、做矢狀對半分開，一半以10%中性福爾馬林固定，EDTA-Na （pH7.4） 脫鈣，石蠟包埋，制備組織病理HE切片，對另一半以DEPC漂洗，冷凍存儲，液氮罐轉入-80℃冰箱以制備基因芯片分析及熒光定量PCR檢測。

1.2 實驗藥品 （1）中藥補腎活血方制備：采用三七6g、當歸15g、血竭9g、川芎10g、生地30g、赤芍15g、枳殼10g、川斷10g、骨碎補20g、補骨脂12g、枸杞子6g、地鱉蟲9g組成補腎活血方。（2）制備方法：稱取30倍量的處方加入適量的水浸泡，然后加入10倍量的水放入密閉式高壓自動煎藥機中煎煮，先后3次，將所得藥液混合，趁熱過濾，2次冷藏、離心后，再濃縮、減壓干燥、碾細，篩得補腎活血湯細粉。實驗灌胃時將補腎活血湯細粉溶化至含生藥2g/ml備用。（3）動物用藥的換算：根據公式：A動物劑量=B動物劑量（mg/kg）×A動物的體表面積比值/B動物的體表面積比值及趙金東［1］報道的激素性股骨頭壞死造模法，大腸桿菌內毒素大鼠的劑量約為20g/kg；甲基強的松龍大鼠用量約為40mg/kg。

1.3 組織病理學觀察 股骨頭放入10%中性甲醛固定，EDTA-Na脫鈣，乙醇脫水，石蠟包埋切片，切片厚4μm，HE染色，光鏡下觀察形態學變化。

1.4 基因芯片分析 基因芯片制作及檢測委托上海伯豪生物技術有限公司完成。

1.5 熒光定量PCR檢測 采用比較Ct值法進行相對定量的數據分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　 結果

2.1 股骨頭HE染色觀察 實驗組：骨髓腔萎縮，營養血管充盈減少，官腔血管密度減低，髓腔血管上移至關節面下。骨小梁間基質增寬、退變，關節軟骨厚度變薄、細胞成熟度欠佳且不均衡、細胞數減少，軟骨生發層萎縮伴有次序紊亂，生長板消失，營養血管供血下降（見圖1、2）。中藥組：大鼠股骨頭骨髓腔未見擴張，營養血管充盈情況良好，血管密度輕度增加，供血良好。骨小梁間基質未見萎縮、退變，關節軟骨厚度接近正常，軟骨細胞成熟，生發層萎縮不顯著，生發層次序存在及生長板有殘留（見圖3、4）。對照組：大鼠股骨頭骨髓腔未見擴張，營養血管充盈情況良好，血管密度，供血好。骨小梁間基質未見萎縮、退變，大鼠股骨頭關節表面軟骨厚度正常，軟骨細胞成熟，生發層正常，生發層萎縮不顯著，生發層次序好及生長板明顯（見圖5、6）。

圖1 實驗組骨髓腔縮小（HE×10）

圖 2 實驗組關節軟骨發育不良（HE×10）

圖3 中藥組骨髓腔未縮小（HE×10）

圖4 中藥組關節軟骨發育（HE×10）

圖5 對照組骨髓腔擴張（HE×10）

圖6 對照組關節軟骨成熟（HE×10）

2.2 基因芯片檢測結果 實驗組比對照組ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A表達明顯下降 （ fold change＞2），中藥組較實驗組則顯著上調，差異均有統計學意義。

2.3 熒光定量PCR檢測 中藥組ASPG、 CRISPLD2和PLA2G2A與對照組大致相同，但比實驗組高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明補腎活血方對于激素性股骨頭壞死的治療切實有效，且效果較為明顯。見表1。

表1 3組ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A基因在股骨頭組織中的相對定量表達值

3　 討論

3.1 補腎活血方對骨壞死的治療作用 補腎活血方在治療骨質疏松癥的療效已得到大量實驗研究及臨床療效的證實［2］。近年相關研究較多，證實補腎活血中藥具有促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化功能。胡黎平等［3］在補腎方劑對大鼠骨髓基質干細胞增殖與分化的影響的實驗研究認為補腎方劑可以促進骨髓基質干細胞的增殖、分化及礦化。也有學者［4］在補腎方劑對大鼠成骨樣細胞增殖及相關酶類的影響的研究中發現補腎方劑在一定的濃度范圍均能增加成骨樣細胞增殖，認為補腎方劑可活躍和增進信號傳導，可能是其促進細胞增殖的一種機制。且補腎活血中藥可以提高骨髓中多種活血、成骨有關因子的表達［5］，還可以抑制骨髓源性破骨細胞的生成［6］。

3.2 早期股骨頭壞死血液粘調性相關基因異常表達的意義 研究認為ASPG參與凝血過程的改變。早期的SINFH模型凝血功能下降，推測其低表達直接或間接參與影響凝血過程。有研究顯示肝臟60-kDa溶血磷脂酶包含了一個天冬酰胺酶樣區和錨蛋白重復序列。當轉染大鼠cDNA編碼的溶血磷脂到HEK293細胞時發現不僅溶血磷脂的活性被表達，天冬酰胺酶和血小板激活因子乙酰水解酶的活性也被表達［7］。不同的錨蛋白重復序列涉及組織的分化和細胞周期的控制，這個錨蛋白重復序列一個主要功能是蛋白質相互作用［8］，重要的是近來也顯示包含一個非鈣依賴的磷脂酶A［9］。錨蛋白重復在非鈣依賴的磷脂酶A2顯示通過低聚復合物的形成參與影響酶活性。這種酶可能與其他可以調節酶的活性蛋白質以復合物的形式存在。識別和描述這樣的結合蛋白在認識60-kDa溶血磷脂酶的調節和生理機能上提供了有用的信息。這些氨基酸在60-kDa溶血磷脂酶的催化活上性起著關鍵作用，且Thr116作為親核物質涉及酰基酶中間物的形成，有報道稱Thr116Asn是早老素presenilin-1 的一個突變體或替代物［10］，可見在早期SINFH大鼠模型中天冬酰胺酶和磷脂酶A2互相作用，共同影響著凝血活性、組織分化和細胞周期的變化，并于這個過程中出現了與致病基因有關的早老性改變，而本資料中，補腎活血方劑在SINFH大鼠病變早期的應用可能改變了這個過程。

PLA2是一種能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，亦是花生四烯酸（AA）、前列腺素及血小板活化因子（PAF）等生物活性物質生成的限速酶，所產生的脂質介質在炎癥和組織損傷時活化膜通道、信息傳遞、改變血流動力學及病理生理過程，并在調節細胞內外代謝中起關鍵性作用［11］。有研究表明多重磷脂酶A2 參與骨關節炎軟骨組織中的炎癥過程，炎癥因子IL-1β，TNF 和 PAF 誘導PLA2的釋放，在骨關節炎時誘導軟骨細胞sPLA2-IID 釋放是個新發現［12］。本資料顯示病變早期除PLA2低表達導致血液粘滯性下降外，還出現因此而致的關節軟骨損傷，說明這些因素的確參與了動物早期模型的建立過程，但在中藥實驗組中被活血補腎湯劑明顯逆轉。

研究表明CRISPLD2的表達并不能改變疾病嚴重程度，CRISPLD2 水平可能潛在反映宿主對感染的反應，調節CRISPLD2表達失敗表明感染已經進入嚴重階段并失控。傳統膿毒癥治療的一個缺點是一旦檢測到內在休克的指征，免疫事件的雪崩式觸發就以全幀速率進行，其再也不能停止，并被逆轉［13］。這有力地證明疾病一旦觸及CRISPLD2的臨界閾限，免疫抑制將進入一個不可逆過程。中藥治療組中差異性表達基因的連續上調提示在其出現差異性表達前就給予中藥制劑對疾病的治療和恢復是至關重要的，證明最有效的治療方式是阻止差異性基因塌方式的啟動。激素性股骨頭壞死早期相關信號傳導分子基因表達均出現明顯下調，提示ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A在早期的SINFH血液粘調度改變過程中起關鍵作用。補腎活血方能有效恢復股骨頭血粘度相關基因表達的改變，促進骨代謝動態平衡恢復，促進早期股骨頭病損的修復。

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Objective To investigate the treatment of early Steroid-induced necrosis of femoral head （SINFH） by Bushen Huoxue decoction，and research the effect on the regulation changes of Gene expression of blood viscosity and correlation with pathomorphology. Methods 30 adult healthy SD rats were involved in this research and randomly divided into experimental group，Chinese medicine group and the control group. The experimental group and Chinese medicine group were intraperitoneally injected endotoxin 20g/kg per day for twice，and then intramuscular injected methyl prednisolone 40ml/kg per day for thrice. After building，Chinese medicine group was given Bushen Huoxue decoction 2ml per day by fi lling the stomach，while the experimental group and control group with the equivalent 0.9% normal saline. All the rats were sacrifi ced in 3 weeks after building. The left femoral heads were stripped neatly and dissected immediately from the coronal plane，and then half of were preparing for the gene chip analysis and fl uorescence quantitative PCR detection. The other half were prepared for paraffi n embedding and sectioned and stained with H& E. Results Histopathological test showed the marrow cavity wasn't expansion but with slight density increasing of blood vessel，blood supply was good，the situation no matter from articular cartilage thickness of femoral head，maturity of cartilage cells，germinal layer showed in Chinese medicine group were better than that of the experimental group，and close to the normal control group. According to the results of Gene chips，compared to the experimental group，the Chinese medicine group had a signifi cant high expression of ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A （fold change＞2）. The results of fl uorescence quantitative PCR detection show that the Chinese medicine group of three genes ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2Aexpression were signifi cantly in the experimental group（P＜0.01）. Conclusion Signaling molecule gene expression are signifi cantly lower in the initial stage of steroid-induced avascular aseptic necrosis of femoral head，prompting that ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A were the key genes in the process of SNFH's occurrence and development. The Bushen Huoxue decoction can effectively restore the femoral head signaling molecule gene related with blood viscosity，promote bone metabolic dynamic balance recovery，repair the early femoral head necrosis.

Steroid-induced femoral head necrosis blood viscosity gene chip Bushen Huoxue Decoction SD rats

浙江省科技廳項目（N20120675、2012C33035）

310003 杭州市紅會醫院（耿艷華 石仕元 謝文君趙毅）310005 浙江中醫藥大學附屬第二醫院（王昌興 董黎強）