羥喜樹堿抗宮頸癌的機制研究

程艷香 陳干濤★

羥喜樹堿抗宮頸癌的機制研究

程艷香 陳干濤★

目的 探討羥喜樹堿（HCPT）對宮頸癌HeLa 細胞作用的機制。方法 利用western blot、GFP-LC3 shRNA轉染、Hoechst染色等對經HCPT處理后的HeLa 細胞進行自噬和凋亡水平的觀察。結果 western blot、熒光顯微鏡的結果均提示，HCPT能夠誘導HeLa 細胞中自噬相關基因Beclin-1、p62以及LC3 的表達增加，從而激活細胞自噬發生；除細胞自噬外，HCPT也可以造成細胞的凋亡，且凋亡出現在自噬觸發之后。結論 HCPT能夠激活宮頸癌HeLa細胞發生自噬，進而誘導細胞凋亡達到抗腫瘤目的。

羥喜樹堿 宮頸癌 自噬 凋亡

宮頸癌（Cervical cancer）是女性生殖道最常見的惡性腫瘤。宮頸癌的治療一般采用手術和放療為主、化療為輔的綜合治療方案。其預后與臨床期別、病理類型等密切相關，有淋巴結轉移的患者預后較差［1］。自噬是真核細胞的一種非細胞凋亡性程序性死亡，又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。自噬現象可能成為包括宮頸癌在內的腫瘤藥物治療的新靶點［2，3］。羥喜樹堿（HCPT）是唯一有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類特異性腫瘤化學治療藥物，有望成為治療惡性腫瘤（包括宮頸癌）一種有效藥物［4］。本實驗旨在研究HCPT對HeLa細胞在自噬與凋亡方面的影響，從細胞信號傳導通路的角度探討其作用機制。

1　 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細胞系HeLa細胞購自中國科學院上海細胞庫；羥基喜樹堿（HCPT）購自美國Santa Cruz公司；RPMI 1640細胞培養液及胎牛血清購自美國Life Technologies公司；GFP-LC3質粒由南京醫科大學基礎醫學院惠贈。Beclin-1，p62，LC-3B，GAPDH等抗體購自美國santa cruz公司； Bax，Bcl-2，cleavecaspase3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法 （1）細胞計數法檢測細胞活力 采用細胞活力檢測試劑盒（CCK8）法檢測細胞活力。以5000 個/孔的密度將HeLa接種于96孔培養板中，12h后，分別加入1，2，4，6，8，10μM羥喜樹堿，每濃度組設6個復孔，同時設立生理鹽水作陰性對照；置于37℃培養箱中繼續培養24h。24h后每孔加入10μl 的CCK-8溶液，放置37℃培養箱繼續培養2h，采用ELX-800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）測定各孔450 nm處的吸光度（a）值。細胞抑制率=1-（用藥組a值/對照組a值）。通過擬合函數曲線計算藥物處理的半數抑制濃度即IC50。（2）Western blot法檢測自噬與凋亡相關蛋白表達 將HeLa細胞均勻接種于60mm培養皿中，藥物處理后用預冷的PBS洗3遍，加入含有100 mmol/L PMSF的裂解液（RIPA）裂解細胞，冰上放置30min充分裂解，4℃條件下12000 r/ min離心15min，取上清液后經BCA法測定蛋白濃度。依次進行質量分數10%SDS-PAGE凝膠電泳，使用PVDF轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h后，4℃封閉一抗過夜，TBST清洗3次（5min/次）后加入相應二抗，室溫下孵育60min，TBST洗3次后進行顯影，實驗重復2次，采用計算機軟件ImageJ分析灰度值并記錄。（3）細胞凋亡形態學變化的觀察 將HeLa細胞接種于6孔板中，每孔1×106，培養過夜，加入相應的藥物分別處理12h和24h，同時設立對照組；細胞經PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15min，加入Hoechst33342（杭州碧云天生物科技有限公司）避光孵育10min，PBS清洗3遍后，在熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察細胞核形態并統計記錄。（4）細胞自噬率檢測 將HeLa細胞接種到6孔板內，培養過夜，使細胞密度達到60%～70%。通過lipofectamine 2000（美國Life Technologies）轉染GFP-LC3質粒體，6h后換完全培養基繼續培養24h。之后加入羥基喜樹堿分別作用12h和24h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察對GFP-LC3的陽性自噬點數進行統計，統計對照組和處理組單個細胞中GFP-LC3點熒光數，每組統計≥25個細胞。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　 結果

2.1 HCPT對HeLa細胞具有毒性作用 不同濃度的HCPT作用于HeLa細胞，結果表明，HCPT對細胞具有明顯的生長抑制作用。其IC50約 為3μM。本實驗 選 取IC50即3μM濃度的HCPT探究其作用機制。見圖1。

圖1 不同濃度HCPT對HeLa細胞的生長抑制作用

2.2 HCPT能夠誘導HeLa細胞自噬蛋白表達變化 給予HeLa細胞以3μM濃度的HCPT分別處理12h和24h，通過western blot檢測，結果顯示，自噬標記蛋白Beclin1表達量增加，而自噬底物標記蛋白p62出現降解，作為自噬發生指標的LC3-II/LC3-I比值也同樣表現出上升，western blot結果表明，HCPT能夠引起HeLa細胞自噬，并隨藥物的作用時間的延長自噬水平也出現升高。見圖2。

圖2 HCPT（3μM）誘導細胞自噬水平增加

2.3 HCPT引起HeLa細胞中GFP-LC3點狀分布增加 GFP-LC3目前被認為是自噬體特異性標簽。是一種檢測自噬發生常用的實驗技術手段，將HeLa細胞轉染GFP-LC3后，用HCPT分別處理12h和24h，在熒光顯微鏡下觀察并對帶有GFP-LC3的自噬點陽性細胞數和總細胞數進行統計。結果顯示，相對于對照組的細胞，HCPT能夠明顯增加細胞自噬體的數量，進一步證明HCPT可以誘發HeLa細胞自噬發生。見圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察經HCPT處理后HeLa中GFP-LC3自噬點的分布變化

2.4 HCPT誘導HeLa細胞凋亡的形態變化 給予HeLa細胞以3μM濃度的HCPT分別處理12h和24h，經過固定，Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察發現，與對照組比較，24h處理組細胞出現細胞核皺縮，染色加深等凋亡形態，而12h處理組并未出現明顯細胞核變化，結果表明，3μM 的HCPT在處理24h細胞后可引發細胞凋亡，而12h作用并不明顯。提示HCPT引發的細胞凋亡是在細胞出現自噬后所引起的。見圖4。

圖4 HCPT誘導HeLa細胞凋亡的形態學變化影響

2.5 HCPT誘導HeLa細胞凋亡相關蛋白變化 為進一步證實HCPT所引發的細胞凋亡現象，通過western blot方法檢測細胞凋亡相關蛋白的變化，結果顯示，在細胞處理24h組中，細胞凋亡相關蛋白Bax 與cleave-caspase-3均出現表達量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達出現下降。而在12h處理組中，上述蛋白并未出現明顯變化。Western blot結果進一步證實HCPT引發的細胞凋亡是跟隨細胞自噬發生后出現的。見圖5。

圖5 HCPT誘導HeLa細胞凋亡相關蛋白變化

3　 討論

喜樹堿是從我國特有的珙垌科植物喜樹中分離提取出的五環生物堿。是唯一具有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類抗腫瘤藥，目前已廣泛應用于臨床。近來國內外已進行大量的研究發現羥喜樹堿作用穩定且不良反應小，可有效誘導多種腫瘤細胞和部分非腫瘤細胞的凋亡［5］。宮頸癌是危害女性健康的第二大常見腫瘤，每年約造成30多萬人死亡，并出現明顯的年輕化趨勢，嚴重威脅廣大女性的健康。目前主要的治療手段仍是放療和化療相結合的綜合治療［6］。

本資料通過western blot和GFP-LC3 shRNA轉染細胞等檢測方法，首次發現HCPT作用于HeLa細胞后能夠引發自噬，并且隨著作用時間的延長，其自噬水平成增強趨勢。本實驗所選取的自噬指標蛋白中，微管相關蛋白1輕鏈3（LC 3）是目前研究較多的自噬標志性物質，其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，被認為是自噬特異性形成指標［7，8］；而另一種蛋白Beclin-1是哺乳動物的自噬調控基因，是自噬發生的觸發器，其表達的上調可誘導自噬的形成，兩種自噬指示蛋白在HCPT的作用下，均出現表達量增加。一些研究發現，在宮頸癌的發生發展中，自噬相關蛋白的表達被抑制，從而下調了自噬的形成，造成腫瘤的不斷生長，另外，也有研究發現，當自噬相關蛋白過表達后，宮頸癌細胞的生長會受到明顯抑制［7，8］，因此，通過誘導自噬形成有可能成為未來宮頸癌治療的策略之一，而本實驗所選取的HCPT這種藥物就是通過誘導自噬的形成來達到抗腫瘤的目的。

同時，除能夠增加細胞的自噬外，作者通過weatern blot以及Hoechst染色也證實HCPT還可以引起細胞凋亡，并且凋亡現象出現在自噬發生之后，表明HCPT作用于細胞后，首先引起細胞自噬水平的升高，進而觸發細胞凋亡信號的啟動，最終導致腫瘤細胞凋亡，達到抗腫瘤的目的。

研究認為，自噬與凋亡的機制之間關系密切，存在著許多重疊的部分。一些觀點則認為自噬是凋亡必需的，當自噬受到抑制時會延緩凋亡的發生，而自噬水平的升高常導致細胞凋亡通路的激活。本資料證實，在宮頸癌細胞中，HCPT的抗腫瘤的機制是首先通過激活細胞自噬，進而觸發細胞凋亡，從而達到其抗腫瘤的目的，也提出自噬和凋亡之間有著密不可分的關系。同樣，其他類似的研究也發現，順鉑作用HeLa細胞后，自噬小體形成數增加，自噬蛋白Beclin-1和LC3表達量也增加，同時激活內質網應激通路，表明內質網應激—自噬反應參與了順鉑對宮頸癌細胞的細胞毒性作用［9～11］。

宮頸癌是威脅女性健康的惡性腫瘤，目前，仍無有效的治療方式。而自噬是維持細胞穩態的重要通路，在疾病中的作用逐步得到認同。本資料表明HCPT在抗宮頸癌發生過程中的機制問題，是通過激活細胞自噬從而抑制宮頸癌細胞的生長，最終導致細胞死亡，為HCPT在治療宮頸癌方面提供理論基礎，也為開發類似藥物提供新的思路。

1 李靜.Beclin1、Caspase3在宮頸鱗癌患者新輔助化療前后癌組織中的表達及其意義.鄭州大學，2010.

2 張碧蓉，謝麗玲.自噬在宮頸癌發生發展及治療中的作用.實用預防醫學，2013，20（6）：768～769.

3 常靚，霍炳杰，馮莉，等.胃癌組織中miR-200a、miR-200b和miR-429的表達及臨床意義.腫瘤防治研究，2013，40（11）：1098～1100.

4 施斌，方超，游美羨，等.聚乙二醇修飾對羥喜樹堿隱形納米囊泡的腫瘤靶向和抑瘤作用的影響.中國臨床藥學雜志，2006，15（1）：46～49.

5 衛薇，趙棟，張志榮，等.羥喜樹堿磷脂復合物理化性質的研究.華西藥學雜志，2008，23（4）：396～399.

6 王贊宏，段振玲，李莉.自噬基因Beclin1抑制宮頸癌HeLa細胞裸鼠移植瘤生長的研究.現代婦產科進展，2011，20（5）：361～364.

7 張碧蓉，謝麗玲.自噬在宮頸癌發生發展及治療中的作用.實用預防醫學，2013，20（6）：768～769.

8 朱興春，劉青松，楊慧敏，等.末端結合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達及其對自噬標志蛋白表達的影響.復旦學報（醫學版），2014，41（5）：641～646.

9 李曉妍.自噬標記蛋白Beclin1、p62在宮頸癌中的表達及臨床意義.安徽醫科大學，2014.

10 文靜.羥喜樹堿對人腎上腺皮質癌SW-13裸鼠移植瘤生長及其DKK-1和β-catenin基因轉錄的影響.廣西醫科大學，2014.

11 張頌婕.自噬基因ARHI與Beclin1在宮頸癌中的表達及意義.吉林大學，2013.

Objective To explore the antitumor mechanism of Hydroxycamptothecin（HCPT） on cervical cancer. Methods Western blotting and Hoechest staining Methods were used to detect the level of apoptosis and autophagy after HCPT being used on Hela which is cervical cancer cell line. Results After using HCPT，the expression of the regulators of Beclin-1，p62 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） were upregulated and then the autophagy of Hela cells were triggered. In the meanwhile，the autophagy induced cell apoptosis . Conclusion HCPT can induce Hela cells apoptosis by stength the cells autophagy.

HCPT cervical cancer autophagy apoptosis

湖北省衛生廳（ 2012Z-Y02）；湖北省衛計委一般面上項目（WJ2015MB084）

430060 武漢大學人民醫院（程艷香）433000 湖北省仙桃市第三人民醫院（陳干濤）
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