HPLC-ELSD法測定膽南星中膽酸類成分的含量

蔡宇憶，葉永浩，楊麗瑩，黃玉梅，吳志堅，馬永德，李書淵

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HPLC-ELSD法測定膽南星中膽酸類成分的含量

蔡宇憶1，葉永浩1，楊麗瑩1，黃玉梅2，吳志堅2，馬永德2，李書淵1

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣州市藥材公司中藥飲片廠，廣東 廣州510360）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法測定膽南星中4種膽酸類成分質量分數的方法。方法 色譜柱為WELCH AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%（體積分數）冰醋酸（體積比60∶40），柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測器為ELSD，載氣流速為2.2 mL/min，漂移管溫度為90℃。結果膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸均在定量范圍內呈良好的線性關系，平均回收率分別為97.62%、98.38%、97.32%、97.86%。結論本方法操作簡單，測定結果準確，可用于膽南星中膽酸類成分的質量分數測定及質量控制。

關鍵詞：膽南星；HPLC-ELSD法；膽酸；豬去氧膽酸；鵝去氧膽酸；去氧膽酸

2015年版《中國藥典》所記載的“膽南星”為制天南星的細粉與牛、羊或豬膽汁經加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經發酵加工而成［1］。目前，膽南星療效成分不完全清楚，膽汁為膽南星主要加工輔料，據現代實驗藥理學研究報道膽汁具有一定鎮靜、安神、調節心血管系統作用［2-3］，因此測定膽汁酸質量分數可以部分反映膽南星藥用質量。古代膽南星炮制一般用牛膽汁，現在逐步發展成用牛膽汁、豬膽汁、羊膽汁，甚至可以采用混合膽汁。2015年版《中國藥典》“膽南星”項下尚無檢查項和含量測定項，其質量評價標準還未完善。由于有關原藥材天南星的毒性物質基礎研究比較少，與傳統

網絡出版時間：2016-05-24 15：34 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160524.1534.003.html藥效相對應的活性成分還不清楚，不容易從中選擇質量控制的指標成分，所以本研究參照文獻［4-5］，選用膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸作為對照品，首次建立HPLC-ELSD法同時測定膽南星中4種膽酸類成分的質量分數測定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（日本島津公司），WELCH AQC18色譜柱，Dikma EasyGuard保護柱；3300 ELSD蒸發光散射檢測器（美國奧泰公司）；XWK-Ⅲ無油空氣泵（天津市津分分析儀器制造有限公司）；BP211D十萬分之一電子天平（德國賽多利斯集團）；AY120萬分之一電子天平（日本島津公司）；SK250HP科導超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；ANKE TGL-16G-A恒溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：10078-0013），豬去氧膽酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-14060906），鵝去氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110806-200303），去氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：724-8601）；甲醇（分析純）；乙腈（色譜純）；蒸餾水。

10批膽南星樣品均產自四川，經廣東藥科大學中藥學院李書淵教授鑒定符合《中國藥典》標準，其來源詳見表1。

表1 10批膽南星樣品來源信息表Table 1 The information of 10 batches of Arisaema cum Bile

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

分別取膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸分別為0.205、1.024、0.952、0.398 mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取膽南星（過4號篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，稱定質量，加甲醇補足減失質量，置離心管中離心（12 000 r/min）10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件及適應性試驗

色譜柱：WELCH AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Dikma EasyGuard保護柱；流動相：乙腈-0.2%（體積分數，下同）冰醋酸（體積比60∶40），流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；蒸發光檢測器載氣流速：2.2 mL/min，漂移管溫度：90℃。精密吸取混合對照品、供試品溶液各20 μL，按上述條件進行測定。色譜圖見圖1。

1.膽酸；2.豬去氧膽酸；3.鵝去氧膽酸；4.去氧膽酸。圖1 混合對照品（A）、膽南星供試品（B）溶液的HPLCELSD色譜圖Figure 1 The HPLC-ELSD chromatogram of mixed references （A）and Arisaema cum Bile（B）

2.4 線性關系的考察

分別取膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸混合對照品溶液0.1、1、2.5、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。分別精密吸取各混合對照品溶液20 μL，按照“2.3”項下條件進行測定。以對照品進樣量對數為橫坐標（X），峰面積的對數為縱坐標（Y）繪制標準曲線，結果見表2。由表2可知，4種膽酸成分均在測定范圍內呈良好的線性關系。

表2 膽南星中4種膽酸類成分的線性范圍、回歸方程及r值Table 2 　The linear relationship，regression equations and rvalues of four cholic acids in Arisaema cum Bile

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20 μL，按“2.3”項下條件進行測定，重復6次，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其RSD值分別為0.38%、0.86%、0.84%、1.33%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后分別進樣，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其RSD值分別為1.81%、1.48%、 1.72%、1.43%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，重復操作6份。分別按“2.3”項下色譜條件測定并記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積。計算得膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸質量分數的RSD值分別為2.86%、1.98%、2.21%、2.50%，表明方法重復性好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知膽酸成分總質量分數的同一批膽南星粉末（批號：20130901）約0.25 g，共6份，精密稱定，分別加入適量膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸對照品溶液，分別按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸的峰面積，計算其平均回收率分別為97.62%、98.38%、97.32%、97.86%，RSD值分別為2.11%、1.96%、1.86%、2.48%。結果見表3。

表3 膽南星中4種膽酸類成分的加樣回收率試驗結果Table 3 The recovery results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=6）

2.9 樣品測定

分別取10批膽南星樣品粉末，各0.5 g，精密稱定，每批重復操作2份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下條件測定并記錄膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸的峰面積，分別計算4種膽酸類成分的質量分數及其總質量分數。結果見表4。

表4 膽南星中4種膽酸成分及總質量分數的測定結果Table 4 The determination results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=2）　w/%

3 討論

本實驗旨在研究建立同時測定膽南星中4種膽酸類成分的方法，從而為制定膽南星的質量標準提供依據。由張能榮［6］對牛、羊、豬膽汁中15種成分的研究結果可知：牛、羊膽汁中無豬去氧膽酸，豬膽汁中不含膽酸與去氧膽酸，而鵝去氧膽酸為3種膽汁共有的成分，據此可以判斷市售的膽南星藥材在炮制過程中加入了何種膽汁。從本試驗結果可以看出，所檢測10個批次的膽南星中采用的膽汁輔料大多是豬膽汁，部分批次采用的是混合膽汁；各樣品膽酸類成分的質量分數差異較大，可能是由于加工過程中加入膽汁類型和加入膽汁量不同導致的——因此把膽酸類成分作為膽南星的質量控制指標是必不可少的。方法學考察結果表明，本法操作簡單，測定結果準確、重復性好，可用于膽南星膽酸類成分的質量分數測定和質量控制。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：245.

［2］王凱平，石朝周.動物膽汁藥用研究的概況與展望［J］.中國中醫藥科技，2000，7（5）：350-352.

［3］白萬富，鞠愛華，楊乾.牛膽汁的化學成分及臨床應用的研究進展［J］.中華中醫藥雜志，2008，23（2）：149-151.

［4］赫炎，張永欣，趙惠東，等.HPLC測定膽南星中豬去氧膽酸的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32（16）：1634-1636.

［5］王光函，姜鴻，鄒桂欣，等.HPLC-ELSD法測定膽南星中膽酸含量［J］.亞太傳統醫藥，2014，10（22）：8-9.

［6］張能榮.牛羊膽汁質量的研究［J］.中草藥，1983，14（7）：15.

（責任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0311-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032301

收稿日期：2016-03-23

基金項目：廣州市荔灣區科技計劃（20133115008）

作者簡介：蔡宇憶（1991—），女，2013級碩士研究生，Email：406371983@qq.com；通信作者：李書淵（1963—），女，教授，從事中藥物質基礎和質量標準研究，Email：1018720684@qq.com。

Determination of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile by HPLC-ELSD

CAI Yuyi1，YE Yonghao1，YANG Liying1，HUANG Yumei2，WU Zhijian2，MA Yongde2，LI Shuyuan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Materia Company，Guangzhou 510360，China）

AbstractObjective To develop a HPLC-ELSD method for the determination of cholic acids from Arisaema cum Bile.Methods WELCH AQ-C18column 4.6 mm×250 mm 5 μm was employed and eluted at 30℃with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.2%glacial acetic acid 60∶40 and the flow rate was 1.0 mL/min.The drift-tube temperature of ELSD was 90℃ and the flow rate of air was 2.2 mL/min. Results Cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid and deoxidation cholic acid had good linearity within the quantitative range and their mean recovery ratios were 97.62% 98.38% 97.32%and 97.86% respectively.Conclusion The method was simple and accurate which could be used for the determination and quality control of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile.

Key wordsArisaema cum Bile HPLC-ELSD cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid deoxidation cholic acid