8味中藥對腸道特征菌的調節作用研究

葉清清，王雅茹，方偉彬，劉廣鋒，馮娟，管淑玉

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8味中藥對腸道特征菌的調節作用研究

葉清清1，2，3，王雅茹1，2，3，方偉彬1，2，3，劉廣鋒4，馮娟4，管淑玉1，2，3

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州510006；2.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州510006；4.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東廣州510300）

摘要：目的研究白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍、黃連、連翹8味中藥對腸道特征菌的調節作用。

方法以嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和大腸埃希菌為試驗菌株，采用比濁法比較8味中藥水提液對以上3株菌株增殖活性的影響，并采用SPSS19.0軟件對結果進行聚類分析，探討上述中藥的作用規律。結果 與對照組比較，終質量濃度為0.01 g/mL（以生藥計）的白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍顯著促進嗜酸乳桿菌的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首烏、白芍顯著促進糞腸球菌的增殖（P＜0.05），益智、當歸顯著促進大腸埃希菌的增殖（P＜0.05），白術、炙甘草顯著抑制大腸埃希菌的增殖（P＜0.05）；黃連、連翹顯著抑制以上3株菌株的增殖（P＜0.05）。聚類分析發現8味中藥對腸道特征菌的作用可分為兩類：白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍為一類，黃連、連翹為一類。結論8味中藥對腸道特征菌的增殖活性有不同的影響，白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍對腸道特征菌的增殖活性作用相似，均能促進嗜酸乳桿菌的增殖；黃連、連翹對腸道特征菌的增殖活性作用相似，能抑制以上3株試驗菌株的增殖。

關鍵詞：中藥；腸道菌；菌群失調；增殖活性；規律分析

腸道菌群一般保持著動態平衡，一旦失衡容易引起腸道菌群失調癥，引發各種疾病［1-2］。定植于健康人體腸道的正常菌群主要分為有益菌（也稱共生菌）和條件致病菌。有益菌緊貼腸道黏膜表面并與黏膜上皮細胞粘連形成生物屏障，發揮營養和免疫調節等作用，它們是腸道優勢菌群，主要包括雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.a）是腸道乳桿菌中的重要成員，其數量多少是衡量腸道菌群正常與否的重要指標之一。

條件致病菌不是優勢菌群，但是人體正常菌群的重要組成部分，主要包括腸球菌屬和腸桿菌屬。糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.f）和大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）是腸道內普遍存在的條件致病菌［3］。近年來的研究發現，中藥在治療腸道菌群失調方面有較好的治療效果［2］。為此，本文以L.a、E.f和E.coli為腸道菌代表，選用白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍、黃連、連翹8種臨床常用中藥，研究它們對腸道特征菌L.a、E.f、E.coli的調節作用，并分析其作用規律，以期為臨床用藥提供參考和依據。

1 儀器與材料

1.1 藥材

白術Atractylodis Macrocephalae Rhizoma，批號：YPA5F0002；炙甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cumMelle，批號：YPA5D0003；益智Alpinae Oxyphyllae Fructus，批號：YPA4G0001；當歸Swertiae Herba，批號：YPA5E0001；制首烏 Polygoni Multiflori Radix Preparata，批號：YPAL0001；白芍Paeoniae Radix Alba，批號：YPA5E000；黃連Coptidis Rhizome，批號：YPA5D0001；連翹Forsythiae Fructus，批號：YPA5A0001，以上藥材購于廣州采芝林藥店，經廣東藥科大學姬生國教授鑒定符合藥典規定。

1.2 菌種與培養基

L.a、E.f由本實驗室從益生菌制劑中分離并鑒定；E.coli（菌株號：ATCC25922）由中國水產科學研究院南海水產研究所鑒定保藏。MRS培養基參照文獻［4］配制，營養肉湯與營養瓊脂培養基參照文獻［5］配制。

1.3 儀器與材料

BLx800全自動酶標儀（美國BioTek公司）；SWCJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國 STIK）；SPX-150B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

2 方法與結果

2.1 中藥對腸道特征菌增殖活性的影響

2.1.1 中藥水煎液的制備 分別稱取8味藥材粗粉各5 g，加水煎煮2次，每次100 mL，合并濾液濃縮并定容至50 mL，得折合生藥量為0.1 g/mL的藥液。根據文獻［6］，使用時稀釋至終質量濃度0.01 g/mL（折合生藥計）。

2.1.2 菌液的制備 取活化后的L.a和E.f，按1%的接種量分別接種于10 mL MRS液體培養基，37℃培養，L.a培養18 h，E.f培養12 h；E.coli活化后，挑取單菌落于營養瓊脂試管斜面37℃培養24 h，用2 mL營養肉湯洗脫，菌液加入裝有8 mL營養肉湯的試管中混合。L.a菌液濃度稀釋至108CFU/mL，E.f、E.coli菌液稀釋至107CFU/mL。

2.1.3 比濁法測定8味中藥對腸道特征菌的增殖活性 各試驗組按表1加入相應體積的中藥藥液、液體培養基和菌液混合均勻，L.a 37℃培養48 h，E.f 37℃培養24 h，490 nm下測定各組吸光度（A）；E.coli 37℃培養18 h，630 nm下測定各組A值，其中A給藥組=A1-A2，A對照組=A3-A4。采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，給藥組和對照組比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。按公式“增殖率=（A給藥組/A對照組）×100%”計算增殖率，見圖1。

表1 中藥活性測定各試驗組的組成與體積Table 1 The composition and volume of the test group for the activity of TCMs

與對照組比較：促進作用，*P＜0.05，**P＜0.01；抑制作用，#P＜0.05，##P＜0.01。圖1 8味中藥對腸道特征菌的增殖活性影響Figure 1 Effect of 8 herbs on the proliferation of representative intestinal bacteria

可見，與對照組比較，終質量濃度為0.01 g/mL（以生藥計）的白術、炙甘草、益智、當歸、制首烏、白芍可顯著促進L.a的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首烏、白芍顯著促進E.f的增殖（P＜0.05），益智、當歸顯著促進E.coli的增殖（P＜0.05），白術、炙甘草顯著抑制E.coli的增殖（P＜0.05）；黃連、連翹顯著抑制3株菌株增殖（P＜0.05）。

2.2 8味中藥對L.a、E.f、E.coli調節作用的規律分析

為判斷8味中藥之間作用的相似性，找到作用規律，以8味中藥對L.a、E.f、E.coli的增殖率為指標，采用SPSS19.0軟件進行聚類分析。本研究采用系統聚類法中的組間連接法對樣本進行聚類，得到的樹狀圖見圖2。

圖2　8味中藥的聚類分析結果Figure 2 Results of cluster analysis of 8 herbs

可見，8味中藥對腸道特征菌的調節作用被聚為兩類：第一類有益智、白芍、炙甘草、白術、當歸、制首烏，這類中藥能顯著促進L.a菌株增殖；第二類有黃連、連翹，這類中藥對3株試驗菌株均有顯著抑制作用。

3 討論

近年來，中藥對腸道菌群的調節研究已在國內外廣泛開展。成揚等［7］發現健脾活血方可以改善酒精性脂肪肝模型腸道細菌群落的構成。鄢偉倫等［8］發現白術會使小鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌增多，腸桿菌減少，腸球菌無變化，進而改善腸道內菌群狀況。羅艷春等［9］發現，白術能增加鹽酸林可霉素導致的腸道菌群失調大鼠模型腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數量，降低腸桿菌數量。本研究經聚類分析發現，歸脾經藥物益智、白芍、炙甘草、白術、當歸和歸肝經藥物制首烏對腸道特征菌調節作用相似，均能顯著促進有益菌的增殖。聚類結果結合文獻分析提示，調肝健脾藥可能具有通過促進有益菌增殖而改善腸道菌群的作用。

黃連、連翹對腸道特征菌的調節作用相似，均能抑制E.f、E.coli和L.a的增殖。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，連翹具有清熱解毒、疏風散熱之功。現代研究證明，黃連、連翹具有抗病原微生物、解熱、抗感染等藥理作用，其治療細菌感染性疾病的顯著功效已被臨床驗證［10］。黃連、連翹性味苦寒，抗菌譜廣，本研究結果顯示黃連、連翹抑制E.f和E.coli生長的同時也會抑制有益菌L.a的生長，故臨床使用應在中醫指導下用藥，以免引起腸道菌群紊亂。

參考文獻：

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［7］成揚，汪海慧，胡義揚，等.健脾活血方對Lieber-DeCarli酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2011，31（1）：73-79.

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（責任編輯：陳翔）

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0291-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012901

收稿日期：2016-01-29

基金項目：國家自然科學基金項目（81001702）；廣州市科技計劃產學研協同創新重大專項項目（201508020016）；海南省科技興海專項項目（2015XH03）

作者簡介：葉清清（1990—），女，2013級碩士研究生，Email：412911504@qq.com；通信作者：管淑玉（1976—），女，博士，副教授，主要從事中藥質量控制與生物活性研究，Email：guanshy3@163.com；馮娟（1974—），女，博士，研究員，主要從事細菌性疾病及免疫防治技術研究，Email：juanf@21cn.com。

Study on the regulation effect of 8 herbs on intestinal diagnostic flora growth

YE Qingqing1，2，3，WANG Yaru1，2，3，FANG Weibin1，2，3，LIU Guangfeng4，FENG Juan4，GUAN Shuyu1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical Univercity，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；4.South China Sea Fisheries Research Institute，China Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China）

AbstractObjective To study the regulation effect on intestinal diagnostic flora of eight herbs including Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpiniae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus.Methods Lactobacillus acidophilus L.a Enterococcus faecalis E.f and Escherichia coli E.coli used as experimental bacteria the bacterial multiplication was measured by the optical density and SPSS19.0 was used to cluster analysis to explore the role of 8 herbs.Results The multiplication results showed that Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

網絡出版時間：2016-05-23 16：38 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1638.005.htmlPraeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the proliferation rate of L.a significantly P＜0.05 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the multiplication of E.f significantly P＜0.05 Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba could promote the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 and Atractylodis Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle could inhibite the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 at the final crude herbal concentration of 0.01 g/mL. Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus inhibited the multiplication of L.a E.f and E.coli significantly P＜0.05 at final crude herbal concetration of 0.01 g/mL.Cluster analysis found that Atractylodes Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba were divided a same class while Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus divided another class.Conclusion 8 herbs showed differrent regulation effects on intestinal diagnostic flora.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba showed a similar proliferative activity on intestinal flora and promoted the proliferation of L.a.Both of Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus showed a similar proliferative activity on intestinal flora and inhibited the proliferation of L.a E.f and E.coli.

Key wordstraditional chinese medicine；intestinal bacteria；alteration of intestina；proliferative activity；regularity analysis