SPG膜乳化法制備PEG-PLGA微球和PLGA微球載藥釋藥特性的對比研究

鐘晨，羅宇燕，郭喆霏，羅永梅，張永明

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SPG膜乳化法制備PEG-PLGA微球和PLGA微球載藥釋藥特性的對比研究

鐘晨1，羅宇燕2，郭喆霏2，羅永梅1，張永明2

（1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.中山大學附屬第三醫院 藥劑科，廣東 廣州510630）

摘要：目的采用SPG膜乳化法，研究制備載蛋白藥物的PEG-PLGA微球的新工藝，并比較PEG-PLGA微球和PLGA微球的載藥釋藥特性的差異。方法以多種PEG-PLGA為載體材料，牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，采用SPG膜乳化法制備緩釋微球；以載藥量、包封率、體外釋放、粒徑等為指標，優化載體材料種類、司盤80用量等參數；采用激光共聚焦顯微鏡、差示掃描量熱法等方法探討PEG-PLGA微球和PLGA微球的載藥釋藥差異的機制。結果 優化的 PEG-PLGA微球形態圓整、粒徑均一，平均粒徑（42.89±0.21）μm，包封率和突釋率分別為91.40%、16.23%，40 d累積釋放率超過90%。結論PEG-PLGA緩釋微球能有效提高載藥量、包封率，降低突釋率，釋藥勻速且完全。

關鍵詞：PEG-PLGA；PLGA；SPG膜乳化法；緩釋微球

網絡出版時間：2016-05-19 9：45 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160519.0945.001.html

利用生物可降解的PLGA將蛋白多肽類藥物制成微球注射劑，可解決這類藥物穩定性差、口服易降解、需頻繁長時間注射給藥等缺點［1-2］。但PLGA作為載體材料存在藥物突釋嚴重，后期幾乎不釋藥以及釋藥不完全等問題［3-4］，添加致孔劑、調整處方工藝參數均無較大改善。PEG-PLGA由于材料親水性的增加，能顯著改善釋藥性能，藥物釋放勻速且完全，并且能最大限度保護蛋白藥物的活性［5］。SPG膜（shirasu porous glass membrane）是日本SPG公司開發的新型無機膜，膜孔徑微小、均勻且可控。SPG膜乳化法原理是分散相在N2壓力的作用下透過微孔膜的膜孔而在膜表面形成液滴，在沿膜表面流動的連續相的沖洗作用下，液滴的直徑達到臨界值后，就從膜表面剝離，從而形成乳液。SPG膜乳化法與傳統乳化技術比較，具有能耗低、反應條件溫和、乳滴粒徑均一可控、操作簡便等優點。

本研究采用SPG膜乳化法，以PEG-PLGA為載體材料制備包載牛血清白蛋白（BSA）的緩釋微球，以載藥量、包封率、粒徑、體外釋藥行為等作為評價指標來進行處方工藝篩選，并對比PEG-PLGA和PLGA 2種載體材料的載藥釋藥特性的差異，探討釋藥影響機制，為PEG-PLGA應用于蛋白類藥物緩釋微球奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MG-20外壓式 SPG膜乳化器（日本 SPG公司）；T25高速勻漿器（美國IKA公司）；JSM-6330F冷場掃描電鏡（日本電子公司）；SL16/40（R）冷凍離心機（美國Thermo公司）；Mastersizer2000激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；CLSM710激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；SDC214差示掃描量熱儀（德國Netzsch公司）；Eon全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 試藥

牛血清白蛋白（BSA，美國Genview公司）；異硫氰酸熒光素牛血清白蛋白（FITC-BSA，美國Sigma公司）；PEG-PLGA（濟南岱罡生物工程有限公司）；PLGA（美國伯明翰公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）。

2 方法

2.1 微球的制備

采用外壓式SPG膜乳化裝置，結合W1/O/W2復乳溶劑揮發法制備微球［6］。

PEG-PLGA微球的制備：稱取藥物粉末，加入適量泊洛沙姆188（F68）溶液充分溶解作為內水相。PEG-PLGA（部分處方加入司盤80作為油相乳化劑）溶解于二氯甲烷作為油相。在冰浴條件下高速勻漿制成初乳。再將初乳作為分散相轉移至SPG膜乳化器的儲罐內，通過N2壓力的作用透過SPG膜的膜孔，進入連續相從而形成復乳。低溫條件下低速攪拌3 h使微球固化完全，離心收集，純化水洗滌3次后冷凍干燥，即得。

PLGA微球的制備：除油相不加司盤80外，其余步驟同“PEG-PLGA微球的制備”。

2.2 微球載藥量和包封率的測定

精密稱取PEG-PLGA載藥微球和PLGA載藥微球約10 mg，置于7 mL離心管中，加入0.1 mol/L NaOH-質量分數2%SDS溶液5.0 mL［7］，置37℃恒溫水浴搖床內勻速振搖48 h，使微球完全裂解，13 000r/min離心5 min后，取上清液進行BCA法蛋白含量測定。同法處理 PEG-PLGA空白微球和PLGA空白微球的裂解液作為背景校正。載藥量和包封率分別按以下公式計算：載藥量=微球中含藥量/微球總質量×100%，包封率=實際載藥量/理論載藥量×100%。

2.3 微球的體外釋放情況

精密稱取PEG-PLGA載藥微球和PLGA載藥微球約 50 mg，加入 10 mmol/L pH7.4緩沖液1.5 mL［7］，置于37℃恒溫水浴搖床中，以100 r/min勻速振搖，分別于5、10 h，1、2、4、7、10、15、20、25、30、35、40 d取出，5 000 r/min離心5 min，將上清液全部取出，加入新鮮的PBS。用BCA法測定上清液蛋白含量，同法處理PEG-PLGA空白微球和PLGA空白微球作為背景校正，計算不同時間點的蛋白釋放量。

2.4 微球的理化性質表征

將PEG-PLGA微球均勻分散在導電膠上，置于真空條件下，噴上金粉，利用冷場發射掃描電子顯微鏡（SEM）在電子束強度為10 kV的條件下觀察微球的形態。采用激光粒度分析儀干法測定微球的粒徑及粒度分布情況。采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）考察微球的相轉變溫度（Tg），分別稱取5 mg的BSA粉末、空白微球、空白微球與BSA的物理混合物以及載藥微球，在10～160℃范圍內，以N2為載氣，以10℃/min的速度升溫，記錄曲線。

2.5 微球內部藥物的分布

將2種載體材料制備的載熒光蛋白FITC-BSA微球分別均勻分散在培養皿中，采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）來觀察微球內部藥物分布的差異。固定吸收波長為488 nm，激發波長為525 nm，放大倍數為100倍。

3 結果與討論

3.1 PEG-PLGA微球的處方優化

3.1.1 PEG-PLGA種類對微球質量的影響 本課題組前期以PLGA為載體材料，采用SPG膜乳化法制備緩釋微球并進行了處方篩選，確定優化處方為：理論載藥量11.11%，聚合物質量分數15%，內水相300 μL，初乳勻漿轉速15 000 r/min，SPG膜孔徑5 μm，膜擠出壓力30 kPa。但研究過程中發現，微球突釋嚴重且仍存在釋藥停滯等問題。新型嵌段共聚物PEG-PLGA以疏水性的PLGA和親水性的PEG為主要組成成分，具有兩親性，可增強與蛋白藥物的相容性而改善其載藥釋藥性能［5］。通過調節聚合方式、PEG分子量、PLGA分子量、乙交酯-丙交酯（LA-GA）比例等可獲得不同性能及用途的嵌段共聚物材料［8］。

本文選取6種共聚物（表1）作為載體材料（其中PLGA的LA∶GA的質量比均為50∶50），按“2.1”項處方工藝制備微球，以篩選合適的載體材料，結果見表1?？梢?，PEG2千-PLGA2.8萬和PEG2千-PLGA3.8萬2種載體材料的載藥量和包封率較高，可能是這2種材料的PEG分子量占比（5%～10%）較適中［9］，使聚合物材料親水性增強，但對PLGA的包封性能影響不大。PEG5千-PLGA2.8萬則由于引入了較長的親水鏈而弱化了PLGA的包封性能，導致載藥量、包封率顯著降低，突釋明顯增強。PLGA5萬-PEG6千-PLGA5萬雖然PEG分子占比合適，但由于三嵌段共聚物黏度增強，相同初乳勻漿轉速下乳化效果減弱，且膜通量降低，導致包封率降低、粒徑分布變寬。

另外，PEG2千-PLGA2.8萬和PEG2千-PLGA3.8萬的體外釋放行為差異也較大（圖1），前者突釋比后者嚴重，從40 d累積釋放率來看，前者累積釋放超過80%，而后者不到50%，且5～20 d期間釋藥幾近停滯?？赡茉蚴呛笳逷LGA分子量增加，黏度增大，降解減緩導致釋藥減緩。但是，據文獻［10］報道，在體內由于酶降解等微環境因素會加速釋藥，可能會影響其體內釋藥行為，需進一步探討二者的體內釋藥規律。

綜合以上分析，以PEG2千-PLGA2.8萬作為載體材料進行下一步研究。

表1　PEG-PLGA種類對微球性質的影響Table 1 The effect of PEG-PLGA species on the properties of microspheres（±s，n=3）

表1　PEG-PLGA種類對微球性質的影響Table 1 The effect of PEG-PLGA species on the properties of microspheres（±s，n=3）

載體材料　　載藥量/%　　包封率/%　　突釋率/%　　粒徑/μm PLGA2萬-PEG6千-PLGA2萬　5.78±0.56　52.06　76.95±1.69　134.55±0.32 PLGA5萬-PEG6千-PLGA5萬　6.62±0.23　59.63　0.73±0.33　118.36±0.30 PEG2千-PLGA1.8萬　5.38±0.44　48.44　48.29±1.10　102.28±0.27 PEG2千-PLGA2.8萬　7.97±0.03　71.77　30.53±1.86　69.45±0.21 PEG2千-PLGA3.8萬　8.18±0.18　73.67　9.94±1.08　58.69±0.27 PEG5千-PLGA2.8萬　3.99±0.66　35.91　55.01±2.35　124.83±0.31

圖1　PEG-PLGA種類對微球體外釋放的影響Figure 1 The effect of different kinds of PEG-PLGA on the release from microspheres（n=3）

3.1.2 司盤80用量對微球質量的影響 試驗中發現，將載體材料改為PEG-PLGA，初乳乳化效果變差，而初乳作為熱力學不穩定體系，乳化效果差會直接導致藥物流失，降低包封率［11］。為改善初乳的乳化效果，結合處方工藝的特點，選擇W/O型乳化劑司盤80與PEG-PLGA共溶于二氯甲烷作為油相使用。

以PEG2千-PLGA2.8萬作為載體材料，司盤80的用量分別為0、25、50 mg，其余按“2.1”項處方工藝制備微球，以篩選合適的司盤80用量，結果見表2?？梢?，加入司盤80后初乳乳化效果顯著改善，外觀乳白細膩。當司盤80的用量為25 mg時，載藥量、包封率增大，突釋率降低，微球粒徑減小且分布變窄。這是由于乳化劑在W1/O界面上吸附形成一定強度的界面膜，抑制內水相液滴間發生合并，并且由于降低了界面張力，在相同的勻漿轉速的情況下，內水相W1更容易被分散為小的乳液粒子，提高體系的穩定性，減少內水相藥物滲出。但是，繼續增大司盤80的用量（50 mg）反而引起包封率下降，可能原因是過多的表面活性分子無法接觸到內水相，不能發揮作用而成為油相的一部分，不均勻地分散在油相中，增大體系的黏性，使得內水相不易被分散為微小的乳液顆粒，擠出形成復乳時易粘連，導致粒徑分布變寬。

體外釋放行為（圖2）顯示，加入適量司盤80對40 d累積釋放率不產生影響；當用量過大（50 mg）時，則顯著延緩藥物的釋放，40 d累積釋放率不足50%，原因可能是因為多余的司盤80溶解于油相中，增大了疏水性而阻滯藥物釋放。

綜合以上分析，司盤80用量在25 mg時效果最佳。載藥量為10.15%、包封率為91.40%、平均突釋率為16.23%、平均粒徑為（42.89±0.21）μm；40 d累積釋放率超過90%，整個釋放周期以較均勻的速度持續釋放；微球形態光滑圓整、粒徑均一且分散性良好。

表2　司盤80用量對微球性質的影響Table 2 　The effect of various amount of Span80 on the properties of microspheres（±s，n=3）

表2　司盤80用量對微球性質的影響Table 2 　The effect of various amount of Span80 on the properties of microspheres（±s，n=3）

司盤80用量/mg載藥量/%包封率/%突釋率/%粒徑/ μm 0　5.86±0.42　52.77　32.53±2.06 71.74±0.39 25　9.64±0.12　86.76　15.05±0.63 41.28±0.19 50　6.79±0.27　61.15　11.01±1.03 54.36±0.27

圖2　司盤80用量對微球體外釋放的影響Figure 2 The effect of various amount of Span80 on the release from microspheres（n=3）

最終確定 PEG-PLGA微球的優化處方為：PEG2千-PLGA2.8萬為載體材料，司盤 80用量為 25 mg，其他參數同“3.1.1”項。

表3　優化處方制備PEG-PLGA微球的性質Table 3 Characteristics of PEG-PLGA microspheres preparedby modified prescription（±s，n=3）

表3　優化處方制備PEG-PLGA微球的性質Table 3 Characteristics of PEG-PLGA microspheres preparedby modified prescription（±s，n=3）

批號　　載藥量/%包封率/%突釋率/%粒徑/ μm 20150901 10.17±0.66　91.51　14.42±0.18　44.51±0.20 20150902 10.01±0.13　90.14　15.96±1.05　42.30±0.21 20150903 10.28±0.25　92.54　18.29±0.32　41.87±0.21

圖3　優化處方制備的PEG-PLGA微球的體外釋放曲線Figure 3 In vitro release of PEG-PLGA microspheres prepared by modified prescription（n=3）

a.SEM圖（1 600×）；b.SEM圖（100×）；c.粒徑圖。圖4 優化處方制備的PEG-PLGA微球的SEM和粒徑分布圖Figure 4 　SEM and diameter distribution pictures of PEGPLGA microspheres prepared by modified prescription

3.3 PEG-PLGA微球和PLGA微球的比較

3.3.1 載藥釋藥性能的比較 PEG-PLGA微球和PLGA微球的載藥性能比較結果見表 4?？梢姡琍EG-PLGA作為載體材料能顯著提高載藥量、包封率，并降低突釋率，微球粒徑縮小且粒徑更加均一。PLGA微球和PEG-PLGA微球的釋放行為差異也較大，前者在10 d以后釋放明顯放緩，40 d累積釋放量不足75%；而后者在整個釋放周期內勻速釋放，40 d累積釋放超過90%（圖5）。將兩者的釋放曲線按 Korsmeyer-Peppas方程 擬合，分別 為 Q= 43.458t0.156（R2=0.994 0）和 Q=21.187t0.450（R2= 0.987 6），根據n值推斷，前者藥物主要以Fick′s擴散為主（n=0.156），而后者釋放是擴散和溶蝕綜合作用的結果（n=0.450）。釋藥機制差異的原因可能是PEG-PLGA微球中親水性鏈段PEG很快降解溶蝕，增加微球內部新的孔洞，使釋放介質更易進入微球內部，進一步加劇PLGA鏈段的降解。并且由于引入PEG鏈段，載藥微球的相轉變溫度（Tg）由45.1℃降至22.1℃，在37℃釋放介質的孵育下，PEGPLGA的聚合物鏈逐漸發生從玻璃態向高彈態的轉化，大分子的運動增加，體積膨脹，加速溶蝕降解。

表4　不同載體材料制備的微球的性質比較Table 4 Different characteristics of microspheres prepared by various carrier materials（±s，n=3）

表4　不同載體材料制備的微球的性質比較Table 4 Different characteristics of microspheres prepared by various carrier materials（±s，n=3）

載體材料　　載藥量/%包封率/%突釋率/%粒徑/ μm PEG-PLGA　10.15±0.16　91.36　15.15±0.49 40.37±0.15 PLGA 　7.13±1.10　64.16　43.60±0.61 56.49±0.24

圖5 不同載體材料制備的微球的釋放曲線

Figure 5 The effect of microsphere carrier materials on the drug release（n=3）

3.3.2 蛋白在微球內部的分布情況 利用CLSM可觀察到樣品中的熒光物質［12］，本文以熒光蛋白FITC-BSA（激發波長：495 nm，綠色熒光）代替BSA作為模型藥物制備微球，通過CLSM觀察熒光蛋白在微球中的分布（圖6）。圖中綠色熒光物質為FITC-BSA，亮度越高的地方表示蛋白量越多。可見，PLGA微球里蛋白較多地分布在微球的表面且聚集在內部孔洞中，而PEG-PLGA微球里蛋白均勻分散，較少吸附在孔壁上，整體熒光強度明顯高于PLGA微球，這與載藥量和包封率測得結果吻合。原因可能是PEG-PLGA的PEG親水鏈段能提高載體與親水性蛋白藥物的相容性和分散性，減少固化過程中藥物隨著水分子擴散而大量吸附于孔洞內壁的情況。

a.PLGA微球；b.PEG-PLGA微球。圖6 不同載體材料制備的微球的CLSM圖Figure 6 CLSM pictures of FITC-BSA microsphere slices prepared by different carrier materials

3.3.3 DSC表征情況 PEG-PLGA微球和PLGA微球的DSC曲線見圖7?？梢?，BSA在102.9、123.5℃有2個吸熱峰，而PLGA載藥微球和PEG-PLGA載藥微球分別只有48.0℃和37.2℃的單峰，BSA的2個吸熱峰都消失了，說明2種材料的微球BSA都被包裹在微球內部，致使其相轉變峰消失。再對比PLGA載藥微球和PEG-PLGA載藥微球，前者在包載BSA前后Tg由28.7℃升至45.1℃、轉變熱焓由2.888 J/g升至6.717 J/g，主要是因為PLGA易與蛋白分子的羥基鍵形成氫鍵，導致鏈段運動困難，使載藥微球的Tg升高、轉變熱焓增加。而PEG-PLGA微球在包載BSA前后，Tg反而由29.4℃降至22.1℃，吸熱峰由47.8℃降至37.2℃，原因可能是PEG的引入增大了鏈端羰基的空間位阻，使得BSA的羥鍵不能與PLGA形成氫鍵，而以無定型態分散于PEGPLGA微球中，反而減小后者分子鏈纏結，增大鏈段的活動空間，使得Tg不升反降。

a.BSA；b.PLGA空白微球；c.PLGA空白微球和BSA的物理混合物；d.PLGA載藥微球；e.PEG-PLGA空白微球；f.PEG-PLGA空白微球和BSA的物理混合物；g.PEG-PLGA載藥微球。圖7 不同載體材料制備的空白/載藥微球的DSC表征曲線Figure 7 DSC thermogram of microspheres prepared by different carrier materials

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（責任編輯：陳翔）

中圖分類號：R944.4

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0269-06

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011202

收稿日期：2016-01-12

基金項目：廣東省醫院藥學研究基金項目（2015SW12）

作者簡介：鐘晨（1989—），女，2013級碩士研究生，Email：loyalty2012@126.com；通信作者：張永明（1965—），男，博士，主任藥師，從事緩控釋制劑研究，電話：020-85253112，Email：874477522@qq.com。

Study on the drug release characteristics of PEG-PLGA microspheres and PLGA microspheres prepared by SPG membrane emulsification

ZHONG Chen1，LUO Yuyan2，GUO Zhefei2，LUO Yongmei1，ZHANG Yongming2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China）

AbstractObjective To study a new prescription process of PEG-PLGA microspheres for protein drugs by SPG membrane emulsification and compare the drug release characteristics of PEG-PLGA microspheres and PLGA microspheres.Methods SPG membrane emulsification was chosen to prepare sustain-released microspheres with bovine serum albumin BSA as model drug and PLGA as carrier material.The material varieties and the amount of Span 80 were optimized to evaluate the drug loading encapsulation efficiency in vitro release particle size.CLSM and DSC were used to study the mechanism of PLGA and PEG-PLGA drug-load and release differences.Results The optimized PEG-PLGA microspheres were round and uniform in shape and size.The average size was 42.89 μm with PDI of 0.21 the entrapment efficiency was 91.40% and the burst release rate was 16.23%.The 40 d cumulative release amount was over 90%.Conclusion PEG-PLGA sustain-released microspheres can effectively increase drug loading and entrapment efficiency lower the burst release rate and release uniformly and completely.

Key wordsPEG-PLGA PLGA SPG membrane emulsification sustain-released microspheres