應用高效液相色譜技術檢測獸藥殘留的研究進展

文/貴州大學動物科學學院 劉金平

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應用高效液相色譜技術檢測獸藥殘留的研究進展

文/貴州大學動物科學學院 劉金平

摘 要高效液相色譜是一種高效而快速的分離與分析技術，是目前分離檢測經常用到的重要方法。因其具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單、工作時間短、可準確分析測定樣品等特點而發展迅速，備受人們青睞。文章通過對近幾年來國內外發表的具有代表性的相關文章進行分析整理和歸納，綜述了高效液相色譜技術的發展和在獸醫藥理學中應用的研究進展。

關鍵詞高效液相色譜；質譜；獸醫藥理學；獸藥殘留

色譜法是指利用待測樣品中各組分在兩相中分配系數不同，當流動相推動樣品中的組分運動并通過固定相時，固定相根據不同物質在不同相態下進行選擇性分配，在兩相中進行連續反復多次分配，從而形成差速移動，不同的物質會以不同的速度以固定相移動最終實現分離［1，2］。根據流動相的狀態可將色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。液相色譜技術經過40多年的發展已在諸多領域得到了越來越廣泛的應用［3～5］。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是在經典的液體柱色譜基礎上，引入氣相色譜技術的理論，采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，達到了高速分離、高靈敏度和操作自動化等目的，從而實現樣品的快速檢測和分析［6］。此法與氣相色譜的主要區別在于流動相是液體而不是氣體，與氣相色譜法相比，由于不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，所以應用范圍更廣泛，特別適合于高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的化合物的分析分離［7］。鑒于高效液相色譜所具有的優點，使更多的人越來越重視對其的研究，高效液相色譜的應用也越來越普遍，這不僅減少了工作的繁雜，也使所得的數據更加真實可靠。

隨著研究工作的不斷深入，高效液相色譜-質譜連用技術也已經出現，并投入到市場使用［8］。高效液相色譜-質譜聯用技術是在高效液相色譜的高分離能力基礎上［9］，利用質譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠準確提供化合物的相對分子質量和結構信息等特點設計，具有分析時間短，對高沸點、難揮發和熱不穩定化合物的分析能力強等優點［10］。

1 高效液相色譜

1.1 高效液相色譜的構造

高效液相色譜主要由貯液罐、高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀以及數據處理裝置8部分組成［11］。

1.2 高效液相色譜的工作原理

高效液相色譜是利用高壓泵將貯液罐中的流動相送入色譜儀系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，隨流動相流動而被運入色譜柱中，由于樣品溶液中的各個組分在流動相和固定相中的分配系數不同，因此在兩相中會做相對運動，經過不斷流動分配，樣品中各混合組分之間漸漸拉開距離，最終以相互分離的單個組分存在，然后依次從柱內流出，利用檢測器的傳感器將樣品濃度轉換成電信號傳送到記錄儀，以圖譜形式將樣品數據打印出來［12］。

1.3 高效液相色譜法的特點

與傳統的色譜法相比，高效液相色譜法有很多優點。①顆粒極細的固定相使流動阻力降低，有效提高了固定相的效率，使分離更加精確。②采用高壓輸送系統提高流動相的流動速度，縮短實驗時間，從而減少操作人員的工作量。③采用高靈敏度檢測器，檢測靈敏度高，紫外檢測器可達0.01ng。④通過流動相可以控制和改善分離過程，同時色譜柱具有高柱效，因此具有高選擇性，既可分析同分異構體，又可分析旋光異構體［13］。

2 高效液相色譜的現狀

2.1 高效液相色譜的發展

隨著科技的不斷發展，科研工作者對高效液相色譜技術的應用越來越普遍。高效液相色譜的發展始于20世紀60年代中后期［14］。20世紀60年代末期，世界上第一臺高效液相色譜儀出現，從此開啟了高效液相色譜的時代，受到很多科研工作者的關注，并且迅速發展起來。后來逐漸出現分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠色譜［15］，目前高效液相色譜-質譜聯用技術已投入使用，這使數據分析更加快捷方便。

2.2 高效液相色譜的應用

通過查閱國內外的參考文獻，高效液相色譜應用非常廣泛。喬坤云等［16］通過高效液相色譜熒光法同時檢測了雞肉中環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星4種氟喹諾酮類藥物殘留的情況。楊遠高等［17］研究表明，高效液相色譜用于分離測定虎杖中白藜蘆醇，高良姜中槲皮素、山奈酚、高良姜素，小兒瀉速停顆粒中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素幾種中草藥效果都非常好，并且該方法簡便快速、靈敏度高、成本低、綠色環保，可用于該制劑的質量控制。蔡良英等［18］運用高效液相色譜方法快速地測定雞蛋中三聚氰胺殘留含量，該方法操作相對簡單，運行成本低，是目前最為常用的檢測方法。張吟等［19］通過研究發現，高效液相色譜可以用于分析測定血漿中多種藥物。王媛等［20］用固相萃取-高效液相色譜法分析測定減肥食品中是否添加雙氫克尿噻、呋噻米、克羅帕米、布美他尼和鹽酸西布曲明等藥物，用于違禁藥物的檢測。

3 高效液相色譜在獸醫藥理學研究中的應用

我國是農業大國，畜牧業的發展受到國家的高度重視，各種保健類和治療類獸藥是經常用到的，各類獸藥在使用時會出現一些不良癥狀，如應激反應，畜禽體內發生耐藥性［21，22］，甚至在很多肉類食品中出現嚴重的獸藥殘留［23］，對人們生活造成嚴重影響。這引起科研工作者對獸醫藥理學的研究更加重視。在進行獸藥殘留的檢測時，普遍使用的就是高效液相色譜技術，目前高效液相色譜-質譜串聯技術更受歡迎。液相色譜-質譜聯用儀主要由高效液相色譜系統和質譜系統兩部分組成，樣品由液相系統進入，經色譜柱分離，被分離的組分依次進入質譜系統，在離子源中離子化，離子聚焦于質量分析器中，根據質荷比而分離，分離后的離子信號轉化為電信號，傳遞至計算機數據處理系統，根據質譜峰的強度和位置對樣品的成分和結構進行分析［24］。該方法可以快速準確地測定、分析數據。

高效液相色譜-質譜聯用技術在獸藥殘留方面應用的報道已經非常多［25］。李小玲等［26］建立的測定諾氟沙星、環丙沙星與恩諾沙星藥物殘留的高效液相色譜-質譜聯用方法，樣品經乙腈提取，正己烷脫脂，旋轉蒸發濃縮，即可進行定性和定量分析。該測定方法成本低，而且時間短。周萍等［27］通過高效液相色譜-質譜聯用技術同時測定蜂王漿中甲硝唑、洛峭噠哇、二甲峭咪哇3種硝基咪哇類藥物殘留的含量，有力地說明了該方法可作為峭基咪哇類藥物在蜂王漿中殘留的含量快速檢測方法。李向軍等［28］建立的同時測定24種性激素的高效液相色譜-串聯質譜法，實現了3類性激素的同時定量及定性確證分析。潘曉東等［29］建立超高效液相色譜-質譜聯用技術測定魚肉中氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟甲砜霉素（FF）殘留含量，并用實驗數據充分地說明該方法具有良好的選擇性、靈敏度和準確度，滿足魚肉中痕量氯霉素類藥物殘留的高靈敏分析需要。熊春蘭等［30］建立了高效液相色譜-質譜串聯法同時測定水產品中喹諾酮類、大環內酯類、磺胺類、磺胺增效劑、林可胺類、硝基咪唑類、喹啉類和多肽類8類共38種限用獸藥殘留的含量，該法方便快捷，可同時對多種獸藥殘留進行快速測定。

4 結語

高效液相色譜技術是目前公認的操作簡單、工作時間較短、能夠快速測定分析藥物的方法，但是隨著社會的進步，科技的不斷發展，為了預防和治療一些新型疾病，各種結構復雜的新型藥物不斷問世，新藥的耐藥性、在體內分布情況等都是人們需要進一步解決的問題。單純地應用高效液相色譜技術已經很難滿足實驗數據測定分析的要求，在短時間內同時完成對一種或幾種藥物的測定分析、確定藥物在機體內的分布情況、藥物在體內的作用位點等都是有待解決的問題。為了解決這些問題，現已經出現在高效液相色譜的基礎上，結合質譜的特點發明了高效液相色譜-質譜聯用技術，解決了部分存在的問題，但是仍存在很多不足，需要進一步改進，如何提高高效液相色譜-質譜聯用技術的靈敏度和精度是以后高效液相色譜技術發展的研究方向。色譜聯用技術還有著很大的發展空間，新的色譜聯用技術有待探索使用。可以看出，各種新型色譜聯用技術的廣泛應用必將對現代研究起到重要的推動作用。

參考文獻：

［1］ 張祥民，張麗華，張玉奎.今年中國色譜研究進展［J］.色譜，2012，30（3）：222～231.

［2］ 張人福，宋曉園.高效液相色譜在藥學的應用概況和最近進展［J］.中國當代醫藥，2013，20（21）：15～18.

［3］ Imene A， Mingluo D， Hang TJ. Identifi cation and determination of related substances in diosmin bulk drug and pharmaceutical formulations by HPLC and HPLC-MS［J］. Chromatographia， 2013，76（9～10）：499～508.

［4］ Shan YC， Zhang LH， Zhang YK， et al. Moldoveanu and Victor David： Essentials in modern HPLC separations ［J］. Anal Bioanal Chem， 2013，405（21）：6611～6612.

［5］ 王新敏，彭蘊茹，景欣悅，等.HPLC法測定大鼠血漿、微粒體中非那西丁與其代謝物含量及其應用［J］.中國藥理學通報，2013，29（4）：591～592.

［6］ Bachate S P， Nandre V S， Ghatpande N S， et al. Simultaneous reduction of Cr（VI） and oxidation of As（III） by Bacillus fi rmus TE7 isolated from tannery effl uent［J］. Chemosphere， 2013，90（8）：2273～2278.

［7］ 黃榮.高效液相色譜技術的應用［J］.科技風，2013（14）：116.

［8］ 尹峰，丁召偉，高潔，等.固相萃取-高效液相色譜/串聯質譜法測定食醋中的3種甜味劑［J］.色譜，2011，29（6）：554～557.

［9］ 鄒永敏.新型熒光衍生試劑在反相高效液相色譜-質譜中的應用［D］.曲阜：曲阜師范大學.2012.

［10］ 胡文兵，汪福意.質譜在金屬抗癌藥物與蛋白質相互作用研究中的應用［J］.質譜學報，2010，31（6）：354～360.

［11］ 馮景春，王芹，馮開.高效液相色譜法的應用與發展前景［J］.廣東化工，2014，41（278）：192.

［12］ 楊更亮，劉海燕.高效液相色譜整體柱在藥物分離分析中的應用進展［J］.中國科學，2010，40（6）：631～640.

［13］ 劉艷蕊，張兆貴.食品安全檢驗中高效液相色譜法的應用現狀［J］.遼寧化工，2014，43（8）：1095～1096.

［14］ 王昕.高效液相色譜研究進展［J］.光明中醫，2011，26（1）：56～58.

［15］ 敖瀟瀟.分析化學中的色譜法分類［J］.河南科技，2011（3）：55.

［16］ 喬坤云，孫濤，劉圣紅，等.高效液相色譜熒光法檢測雞肉中4種氟喹諾酮藥物殘留［J］.儀器分析，2015（6）：43～46.

［17］ 楊遠高.高效液相色譜法在幾種中草藥中的應用研究［D］.重慶：西南大學，2013.

［18］ 蔡良英，趙陽，丁春燕，等.基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法［J］.2015，56（11）：1772～1776.

［19］ 張吟，陳一農，陳崇宏.固相萃取-高效液相色譜法分析血漿中的13種藥物［J］.中國藥學雜志，2010，45（21）：1648～1651.

［20］ 王媛，張文韜，李斯特，等.固相萃取-高效液相色譜法同時測定減肥功能食品中五種違禁藥物［J］.四川大學學報，2010，41（5）：873～876.

［21］ 朱永官，歐陽緯瑩，吳楠，等.抗生素耐藥性的來源與控制對策［J］.中國科學院院刊，2015，30（4）：509～516.

［22］ D'Costa V M， King C E， Kalan L， et al. Antibiotic resistance isancient［J］. Nature，2011，477（7365）：457～461.

［23］ 韋志文，楊飛，覃永固，等.淺議肉食品安全體系中獸藥使用存在的一些問題及對策［J］.廣西畜牧獸醫，2014，30（4）：219～220.

［24］ 陶昕晨，黃和，廖建萌，等.高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測蝦肉和豬肉中氯霉素甲砜霉素氟苯尼考和其代謝產物氟苯尼考胺殘留［J］.中國食品學報，2014，14（1）：232～239.

［25］ 王俊菊，高木珍，包建民.高效液相色譜串聯質譜技術在獸藥殘留檢測中的應用進展［J］.中國獸藥雜志，2011，45（7）：45～51.

［26］ 李小玲，黃向榮，萬譯文，等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星［J］.中國漁業質量與標準，2013（4）：25～30.

［27］ 周萍，李英華，徐權華，等.高效液相色譜-串聯質譜聯用測定蜂王漿中硝基咪哩類藥物殘留［J］.中國蜂業，2012（63）：59～64.

［28］ 李向軍，于慧娟，馮兵，等.高效液相色譜串聯質譜法同時測定水產品中24種性激素［J］.分析試驗室，2012，31（5）：62～67.

［29］ 潘曉東，吳平谷，姜維.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定魚肉中氯霉素甲砜霉素和氟甲砜霉素［J］.中國食品衛生雜志，2014，26（6）：572～574.

［30］ 熊春蘭，郭平，占春瑞，等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中8類38種獸藥殘留［J］.分析測試學報，2013，32（2）：193～198.