茶皂素水酶法提取工藝及純化方法

周紅宇++楊德

摘要：利用水酶法，以油茶籽粕為原料，采用正交試驗法優化了纖維素酶酶解提取茶皂素工藝，并對殼聚糖-蛋白酶聯用純化茶皂素進行了研究。結果表明，蛋白酶處理可顯著降低提取液中蛋白質含量和殼聚糖絮凝時茶皂素損失率；各因素對油茶皂素提取率影響順序為酶添加量>料液比>提取溫度>提取時間，最佳提取工藝為酶添加量 6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時間120 min。

關鍵詞：水酶法；茶皂素；提取純化

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2016）05-0362-03

茶皂素別稱茶皂苷，是存在于山茶科（茶、油茶、山茶）植物中的一類五環三萜皂苷類物質，是一種性能優良的天然非離子型表面活性劑，在工業、醫藥、農業等領域有廣泛用途[1-2]。目前，提取茶皂素的方法主要有水浸提法、有機溶劑提取法、吸附法、超聲波提取法、微波輔助提取法等，其中有機溶劑提取法應用廣泛，但存在工藝復雜、條件要求高、能耗高、環境不友好等問題，限制了其產業化規模。因此尋找簡單、經濟、高效且適合工業化生產的茶皂素提取純化方法非常必要。本研究以油茶籽粕為原料，以水代替有機試劑進行油茶皂素提取，探索酶解工藝、殼聚糖絮凝工藝在茶皂素提取上的應用，旨在為茶皂素工業化生產提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

油茶籽粕由湖北省廣水市涂氏農業開發有限公司提供，70 ℃ 烘干后粉碎，過40目篩，置于干燥器中備用。15 000 μ/g纖維素酶（國藥控股有限公司）、10 000 μ/g木瓜蛋白酶（上海沃凱生物技術有限公司）、茶皂素標準品（純度98%、上海紫一試劑廠）；試劑均為分析純。HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）、FA1004B分析天平（上海越平科學儀器有限公司）、GL-25MS高速冷凍離心機（上海盧湘離心機儀器有限公司）、TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2試驗設計

1.2.1單因素試驗研究酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間等4個因子對茶皂素溶出率的影響。

1.2.1.1酶添加量對茶皂素溶出率的影響在料液比為 1 g ∶10 mL，酶解溫度為 55 ℃，酶解時間2.5 h條件下，考察酶添加量對油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.2料液比對茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，酶解溫度55 ℃，酶解時間2.5 h條件下，考察料液比對油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.3酶解溫度對茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，料液比為1 g ∶20 mL，酶解時間2.5 h 條件下，考察酶解溫度對油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.4酶解時間對茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，料液比為1 g ∶20 mL，酶解溫度為55 ℃條件下，考察酶解時間對油茶皂素提取率的影響。

1.2.2多因素正交試驗通過以上單因素試驗，得出每個單因素的最佳值，設定不同酶的添加量、提取時間、提取溫度、料液比進行L9（34）正交試驗。

1.3測定方法

1.3.1油茶籽粕成分分析測定油茶籽粕中水分、總糖、蛋白質、脂肪、粗纖維、茶皂素含量。

1.3.2茶皂素提取方法稱取處理后的油茶籽粕50 g置于1 000 mL燒杯中，按試驗設計的料液比加入蒸餾水、纖維素酶，設定提取溫度與提取時間，提取完成后離心，取上清液備用。

茶皂素提取率=提取液中茶皂素濃度×提取液體積原料質量×100%；（1）

1.3.3蛋白酶酶解方法取提取液離心后得到的上清液500 mL，調節pH值為6.5，加入木瓜蛋白酶以除去提取液中的蛋白質，酶解條件為：酶添加量1%，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，計算酶解前后提取液中蛋白質含量和蛋白質去除率。

蛋白質去除率=酶解前提取液中蛋白質濃度-酶解后提取液中蛋白質濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%；（2）

1.3.4殼聚糖絮凝取蛋白酶酶解前后的提取液100 mL，考察1%殼聚糖溶液添加量及絮凝時間對皂素純化效果影響。

茶皂素損失率=絮凝前提取液中茶皂素濃度-絮凝后提取液中茶皂素濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%；（3）

蛋白質去除率=絮凝前提取液中蛋白質濃度-絮凝后提取液中蛋白質濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%。（4）

1.3.5其他指標參照GB 5009.3—2010 《食品安全國家標準 食品中水分的測定》規定的方法測定水分含量；采用索式提取法測定脂肪含量；采用濃硫酸-香草醛法[3] 測定茶皂素含量。采用雙縮脲法[4] 測定蛋白質含量。采用 GB/T 6434—2006 《飼料中粗纖維測定方法》規定的方法測定粗纖維含量。采用苯酚硫酸法測定總糖含量。

2結果與分析

2.1油茶籽粕主要成分

由表1可知，油茶籽粕總糖含量為31.07%，粗纖維含量17.69%，蛋白質含量13.60%，總糖、蛋白質含量較高會對茶皂素提取、純化產生影響。粗纖維主要由細胞壁成分組成，其存在會影響皂素溶出，因此，通過添加纖維素酶使粗纖維酶解從而促進茶皂素溶出。

表1油茶籽粕主要成分含量

指標含量（%）水分8.32總糖31.07蛋白質13.60脂肪6.50粗纖維17.69茶皂素13.09

2.2單因素試驗結果

2.2.1酶添加量對油茶皂素提取率的影響不同酶的添加量對油茶皂素提取率的影響如圖1所示，油茶皂素提取率隨纖維素酶添加量的增加先升高后降低，酶添加量為4 mg/g時提取率最高，達到12.79%。纖維素酶可破壞植物的細胞壁，從而促使茶皂素等成分溶出；另一方面，茶皂素具有親脂性，酶添加量增加時茶皂素提取率降低可能和脂肪浸出率增加有關。

2.2.2料液比油茶皂素提取率的影響從圖2可以看出，隨著料液比的增加，茶皂素提取率隨之增加，考慮到后續濃縮成本，選擇1 g ∶20 mL作為最佳料液比。

2.2.3提取溫度對油茶皂素提取率的影響由圖3可知，隨著提取溫度的增加，茶皂素提取率先升高后降低，提取溫度達到55 ℃時，提取率最高，因此茶皂素提取工藝的提取溫度確定為55 ℃。在一定范圍內，溫度升高時酶活性增大，水活度增加也更有利于成分溶出；溫度達到一定高度會抑制酶活性，導致提取率降低。

2.2.4提取時間對油茶皂素提取率的影響由圖4可知，茶皂素提取率與提取時間呈正相關，即提取時間越長油茶皂素提取率越高，但90 min后油茶皂素提取率增加趨勢趨緩，提取時間延長會增加能耗，因此選擇120 min作為正交試驗提取溫度。

2.3正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，對選定的酶添加量、料液比、提取時間、提取溫度等4 個因素進行L9（34）正交試驗，考察酶添加量、料液比、提取時間、提取溫度的綜合作用。試驗因素水平見表2，試驗結果見表3。從表2、表3可看出，各因素對油茶皂素提取率影響由大到小為A>B>C>D，試驗最優條件為A3B3C1D2，即酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時間120 min。

2.4殼聚糖絮凝純化茶皂素工藝

殼聚糖在烯酸溶液中分子鏈中帶有大量的正電荷，是天然絮凝劑，可以對蛋白質、核酸、多糖等大分子絮凝回收。由圖5、圖6、圖7可知，酶解前，隨著殼聚糖添加量增大，茶皂素損失率增加，添加3 mL 1%殼聚糖溶液時茶皂素提取率為957%，蛋白質含量下降至140 μg/mL，茶皂素損失率在25%左右；酶解后殼聚糖絮凝時茶皂素損失率顯著降低，添加 3 mL 1%殼聚糖時蛋白酶對蛋白質酶解效率較高，酶解后提取液中蛋白含量下降至63 μg/mL左右，茶皂素損失率約為10%，相比酶解前蛋白含量下降更顯著，同時茶皂素損失率較

低。絮凝時間延長，茶皂素損失率增大，同時蛋白質等雜質的去除率也增大，由試驗可知，添加3 mL殼聚糖溶液，絮凝4 h即可取得較好的效果。

3結論

纖維素酶是酶的一種，在分解纖維素時起生物催化作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖，在食品行業和環境行業均有廣泛應用[5-9]。提取茶皂素時，纖維素酶的加入可增大茶皂素分子向溶劑溶出的通道，從而提高茶皂素提取率。本研究結果表明，纖維素酶的加入可提高茶皂素水提取的得率，最佳提取工藝為酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時間120 min。殼聚糖的加入可有效去除提取體系中的蛋白質等雜質，在未經蛋白酶酶解的提取體系中，殼聚糖絮凝蛋白質等大分子易導致茶皂素損失率較大，這可能與茶皂素與糖類大分子、蛋白質的結合有關[10]。蛋白酶酶解后，添加殼聚糖絮凝時茶皂素損失率下降，表明蛋白酶處理可作為殼聚糖絮凝除雜前的必要步驟。

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