家蠶敗血病病原拮抗菌的鑒定與抑菌作用

李夢茜++蔡永振++嚴茗

摘要：從木論喀斯特森林保護區土壤中分離獲得1株對家蠶敗血病病原具有顯著拮抗作用的菌株，并研究其對家蠶敗血病的抑菌效果，以期為新型微生物農藥的開發奠定基礎。拮抗菌株的發酵產物對敗血菌具有較強的拮抗作用，抑菌圈直徑平均為22.60 mm，抗菌發酵液最大稀釋倍數可達60倍。根據菌株的形態特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析對其鑒定為Paenibacillus polymyxa，命名為Paenibacillus polymyxa HC2015。

關鍵詞：家蠶；敗血病；拮抗菌；抑菌作用

中圖分類號： S884.4+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0328-02

細菌、真菌、病毒分別為家蠶疾病的三大病原。家蠶敗血病（Bacterial septicemia）是很嚴重的細菌病害，目前主要以化學藥品防治敗血病。大量使用化學藥品易導致環境污染并威脅人體健康，因此采用生物制品取代化學藥品是大勢所趨。篩選家蠶病原物拮抗菌對生態蠶業的發展具有重要意義。

目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸出，學者從土壤、水、植物體內篩選分離拮抗菌菌株，并證實其在生物防治、促進生物健康發育等多個方面具有利用價值[1-3]。然而，生物防治主要應用于植物病害，關于動物病害防治的研究鮮見報道。筆者所在課題組從木論喀斯特森林保護區土壤中篩選出1株對家蠶敗血病病原具有顯著拮抗作用的菌株，且其抑菌譜較廣，對金黃色葡萄球菌、家蠶病原菌敗血菌、蘇云金芽孢桿菌、黑霉菌、大腸桿菌等多種動植物病原菌均有較強的拮抗作用。本試驗檢測了A-02菌株對家蠶敗血病的拮抗作用，以期為新型蠶桑用微生物農藥的開發提供依據。

1材料與方法

1.1材料

家蠶敗血菌（Bacterial septicemia）由筆者所在實驗室保存，家蠶敗血病菌病原拮抗菌菌株從木論喀斯特森林保護區土壤中篩選獲得。

1.2菌懸液制備及分離培養

稱取土壤10 g，于滅菌研缽中研碎，將100 mL無菌水加入滅菌研缽，振蕩10～20 min，即為10-1的土壤懸液；靜置 5～10 min，吸取上清液1 mL，依次梯度稀釋，分別配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度的稀釋液。取0.1 mL懸液均勻涂布于培養皿中，待表面干燥后，于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養4～5 d，根據菌落的大小、形狀、邊緣形狀、表面結構、光澤、透明度、顏色等微生物菌落特征挑出單菌落并編號。

1.3拮抗性能的檢測

采用平板對峙法檢測菌株拮抗，設置3個重復，于28 ℃下培養45 d。依據病原菌與拮抗菌之間的距離判斷拮抗作用大小，保留拮抗效果優良的菌株。

采用平板擴散法檢測發酵液活性，利用PDA 液體培養基，于28 ℃下培養16～24 h，記錄發酵液擴散形成抑菌圈的最大稀釋倍數。篩選拮抗效果和發酵性能優良的菌株。

1.4菌體形態特征及生理生化指標的測定

菌體形態及最適pH值測定、過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗、氧化酶試驗、脲酶試驗、吲哚試驗測試、淀粉水解、V. P試驗及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇發酵試驗均參照相關文獻中的方法[4]進行。

1.516S rDNA序列測定及其系統進化樹的構建

16S rDNA序列PCR測定以通用的27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物，以提取的總DNA為模板。PCR技術擴增16S rDNA序列的反應程序為：94 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增出16S rDNA后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，經DNA膠回收試劑盒純化后，直接郵寄至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。將測序結果在NCBI上進行比對分析，并篩選出9株菌株16S rDNA的全序列，采用ClustalW軟件構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1菌株的分離篩選

經拮抗性能檢測篩選到1 株對家蠶病原菌（金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌）均有較強拮抗作用的菌株，編號為 A-02。該菌株對敗血病菌的抑制效果較強，抑菌圈直徑平均為22.60 mm，抗菌發酵液最大稀釋倍數可達到60倍（圖1）。由表1可知，A-02菌株及其發酵液對敗血病菌、蘇云金桿菌的拮抗作用最強，對金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌也有一定拮抗作用；發酵液稀釋40～60倍時，對上述病原菌的拮抗作用仍明顯，可見該菌株的發酵性能良好。

2.2拮抗菌培養形態特征及革蘭氏染色結果

A-02菌株在PDA培養平板上生長的菌落特征為乳白色菌落、有光澤、菌落光滑、半透明。A-02菌株革蘭氏染色為陽性；芽孢為橢圓型，菌體形態為桿狀，芽孢、細胞壁革蘭氏染色均為陽性。

2.3生理生化特征

A-02菌株為好氧菌，可于厭氧條件下生長。菌體受pH值影響不大，在pH值5～9區間培養抑菌效果良好（圖2）。不能利用天門冬素培養基作為氮源，可利用無機氮源。A-02 菌株過氧化氫酶試驗有氣泡產生，為陽性；甲基紅試驗為黃色，呈陰性反應；氧化酶試驗為陽性；脲酶試驗為陰性反應；吲哚試驗為陰性反應；葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇發酵試驗反應為陽性；水解淀粉試驗為陽性反應，表明該菌株可分解淀粉；該菌株可使明膠液化；V. P試驗呈紅色，為陽性反應。

2.4系統進化樹的構建與分析

將測序所得A-02菌株的16S rDNA堿基序列于NCBI數據庫BLAST上進行比對，選取9株同源性高的菌株構建系統進化樹（圖3）。A-02菌株以100%的同源性屬于Paenibacillus polymyxa。

根據形態特征和生理生化指標，鑒定該菌株屬于多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），依據系統命名法將其命名為Paenibacillus polymyxa HC2015。

3討論

化學藥物的過量使用使病原病害產生惡性抗藥性，破壞生態環境，研發高效、安全的生物藥物是大勢所趨[5-6]。生物藥物的廣泛利用須滿足遺傳穩定性、抗逆性2個必備條件，而A-02 菌株的遺傳穩定性與抗逆性滿足生物藥物的要求。通過16S rDNA的序列同源性、菌株形態特征、生理生化指標鑒定該菌株為多黏類芽孢桿菌。由于A-02菌株高產抗菌活性物質，是一種較好的拮抗菌，對動植物病原菌具有較強的抑制活性，起到抗病作用。本研究對于探索家蠶病原物的生物防治方法以及蠶業發展具有重要意義。

參考文獻：

[1]查傳勇，董法寶，楊悅，等. 洋蔥伯克霍爾德氏菌Lu10-1產生抗菌活性物質的發酵培養基和發酵條件優化[J]. 蠶業科學，2009，35（2）：229-235.

[2]Agodi A，Mahenthiralingam E，Barchitta M，et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis：Prevalence，epidemiology，and genomovar status[J]. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（8）：2891-2896.

[3]Parke J L，Gurian S D. Diversity of the burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains[J]. Annual Review of Phytopathology，2001，39：225-258.

[4]布坎南 R E，吉本斯N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 8版. 北京：科學出版社，1984.

[5]張愛華，任志成，王壯，等. 不同生物源農藥對西洋參主要病害的室內抑菌活性及田間防效[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11）：197-200.

[6]馬麗，王開梅，李維林，等. 蒺藜提取物作為生物農藥的效果[J]. 江蘇農業科學，2014，42（3）：86-87.唐瞻楊，蔣毅，周宇，等. 三元雜交尼奧羅非魚組合的初步研究[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：330-332.