湖南和福建辣椒上辣椒脈斑駁病毒的檢測及系統發育分析

劉健++張德詠++張松柏

摘要：辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV），目前在我國僅有在海南黃燈籠辣椒上嚴重危害的報道。利用湖南省和福建省采集的辣椒樣本，檢測辣椒ChiVMV的檢出率，并克隆ChiVMV的CP基因序列，用鄰近法構建了系統進化樹，分析其遺傳進化情況。結果表明，辣椒的ChiVMV省檢出率湖南省為25%，福建省為20%；克隆了湖南省和福建省ChiVMV CP基因各1個，系統發育表明，湖南省和福建的ChiVMV株系與源于韓國ChiVMV株系聚在一個亞簇，而與我國其他地區ChiVMV親緣關系較遠，表明侵染辣椒的ChiVMV在我國進一步擴展，且存在遺傳分化趨勢。

關鍵詞：辣椒脈斑駁病毒；檢測；CP基因；系統發育分析

中圖分類號： S436.418.1+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0184-02

辣椒，一種茄科辣椒屬植物，原產于中南美洲熱帶地區，在全世界都有廣泛栽培，是世界上消費量最大的蔬菜之一。我國辣椒種植面積高達140萬hm2以上，占據我國所有蔬菜作物種植面積的10%[1]。辣椒病毒病是威脅辣椒安全生產的重要病害，目前能夠侵染辣椒的病毒有40多種[2-3]，其中辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是危害辣椒作物的最主要病毒之一；該病毒于1979年首次在馬來半島的辣椒作物上被發現[4]，隨后在世界上許多國家的辣椒作物上陸續被報道[5-7]。ChiVMV主要依靠蚜蟲進行非持久性傳播[4]，還能通過病株汁液和機械接觸等方式傳播，不能通過種子傳播，因此，其傳播擴散速度非常快。

在我國，ChiVMV首先在海南省被報道，嚴重危害海南的黃燈籠椒[8]，隨后在陜西、云南等地區相繼發生[8-10]。然而，到目前為止，尚未見ChiVMV在湖南以及福建等地區的報道。鑒于ChiVMV對辣椒生產的威脅，本研究檢測了湖南和福建等地辣椒上ChiVMV的發生情況，克隆了湖南和福建等地ChiVMV株系的CP基因，并分析了其系統發育關系，以期為明確我國ChiVMV的分布及遺傳進化提供科學依據。

1材料與方法

1.1供試材料

辣椒樣品：2013年8月，在湖南省和福建省進行辣椒病毒病調查，發現部分地塊辣椒病毒病的發病癥狀與ChiVMV類似，表現為植株矮小，葉片畸形（包括葉片黃化、葉卷曲、葉面枯斑、葉沿皺縮等）。采集湖南省辣椒樣本16個、福建省辣椒樣本8個。

ChiVMV ELISA檢測試劑盒購自美國RB公司；cDNA試劑盒、DNTP、氨芐青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和DNA回收試劑盒均購自北京全氏金生物技術有限公司，Trizol試劑盒購自Ambion公司，Elisa試劑盒購自RP公司；供試引物由華大基因公司合成，DNA測序測定由生物工程（上海）有限公司完成。

1.2ELISA檢測

ELISA檢測具體操作步驟按說明書進行。陽性對照為試劑盒自帶ChiVMV病毒初提純物；陰性對照為溫室內健康辣椒苗的研磨液。

1.3RT-PCR

Trizol法抽提辣椒葉片總RNA，取500 ng總RNA，采用 All-in-one First-Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA。以合成 cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，34個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增引物ChiVMV CP特異性引物，CPF（5′-GCGGGAGAGAGTGTTGATGCTG-3′），CPR（5′-TCGCCACTATTGAACAGCTTAAC-3′）；1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物，回收符合預期大小的條帶，送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.4序列進化分析

從Genbank數據庫中下載了9個ChiVMV典型分離物的CP基因序列。利用CLUSTAL W對所有CP序列進行多序列聯配，利用Mega 5.0采用鄰接法，構建ChiVMV CP 基因的系統發育樹[11]。

2結果與分析

2.1ChiVMV ELISA檢測

ELISA檢測結果表明，從湖南采集的16個辣椒樣本中，共有4個樣本呈現陽性；而從福建采集的8個樣本中，檢測出2個陽性樣本。

2.2ChiVMV CP基因克隆與序列分析

RT-PCR結果表明，擴增得到大小為1 100 bp的條帶（含ChiVMV CP全基因序列以及部分上游基因序列），與預期大小一致。將RT-PCR擴增得到的條帶進行序列測定，截取ChiVMV CP基因序列，輸入NCBI進行比對，比對結果表明，福建和湖南等地的ChiVMV株系CP基因與來源于韓國辣椒的ChiVMV序列同源性最高（>97%）。

2.3序列的系統發育分析

從ChiVMV-hn和ChiVMV-fj的系統發育樹（圖1）可以看出，發育樹共分成3個分支，分別為韓國株系分支、印度株系分支和中國株系分支，具有很強的地域性；而ChiVMV-hn和ChiVMV-fj與韓國的2個分離物（AJ972878.1和AM909717.1）構成1個分支，表明湖南和福建等地的ChiVMV株系與韓國ChiVMV的親緣關系較近。系統發育分析還表明，我國辣椒上的ChiVMV具有遺傳分化的趨勢。

3結論

ChiVMV是一種（+）ssRNA病毒，是Potyvirus Y病毒屬的確定種，該病毒的存在嚴重制約著韓國、印度、泰國等國和我國臺灣等地的辣椒生產，是造成這些地方辣椒減產的最主要原因之一[4，12]。本研究采用ELISA以及RT-PCR方法在湖南省和福建省等地的辣椒病樣檢測到ChiVMV，表明ChiVMV在我國的侵染范圍正逐步擴展，對我國辣椒的生產具有潛在的威脅。

ChiVMV湖南和福建等地的CP基因序列的系統發育分析顯示，我國的ChiVMV存在遺傳分化的趨勢；由于ChiVMV不同株系對辣椒的致病性存在差異，因此，我國ChiVMV的株系分化情況，急需開展進一步的研究，為分析ChiVMV對辣椒的危害提供科學依據，同時為該病毒的科學防控提供科學參考。

參考文獻：

[1]孫國勝，馬志虎，孫春青，等. 早春辣椒連作免耕栽培技術[J]. 中國蔬菜，2015，28（1）：55-56.

[2]Watterson J C. Development and breeding of resistance to pepper and tomato viruses[M]//Kyle M M. Resistance to viral diseases of vegetables：genetics and breeding. New York：Timber，1993：80-101.

[3]Green S K，Kim J S.Characteristics and control of viruses infecting peppers：a literature review[R]. Taiwan：Asian Vegetable Research and Development Center，1991.

[4]Ong C A，Varghese G，Ting W P. Aetiological investigations on a veinal mottle virus of chill（Capsicum annuum L.）newly recorded from peninsula Malaysia[J]. Mardi Res Bull，1979，7：78-88.

[5]Chiemsombat P，Sac-Ung N，Attathom S，et a1.Molecular taxonomy of a new potyvirus isolated from chilli pepper in Thailand[J]. Archive of Virology，1998，143（10）：1855-1863.

[6]Nono-Womdim R，Swai I S，Chadha M L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Solanum aethiopicum in Tanzania[J]. Plant Disease，2001，85（7）：801-801.

[7]Anindya R，Joseph J，Gowri T D S，et a1.Complete genomic sequence of pepper vein banding virus（PVBV）：a distinct member of the genus Potyvirus[J]. Arch Virol，2004，149：625-632.

[8]Wang J，Liu Z，Niu S，et a1. Natural occurrence of Chilli veinal mottle virus on Capsicum chinense in China[J]. Plant Disease，2006，90（3）：377.

[9]Tan G T，Shi L L，Shang H L，et a1.Diagnosis of viruses in chili pepper in Shanxi Province[J]. China Capsicum，2003，3：32.

[10]Ding M，Yang C，Zhang L，et a1.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Nicotiana tabacum in Yunnan，China[J]. Plant Disease，2011，95（3）：357.

[11]K. Tamura，D. Peterson，N. Peterson，et a1. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739 .

[12]Nono-Womdim R.An overview of major virus diseases of vegetable crops in Africa and some aspects of their control[M]//Hughes J，Odu B. Plant virology in sub-Saharan Africa.Ibadan：International Institute for Tropical Agriculture，2004：211-232.朱弘元，康健，范昕，等. 解淀粉芽孢桿菌B15產脂肽的分離鑒定及抑菌機理[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：186-189.