煙草合子時期特異表達基因的克隆與分析

羅岸

摘要：在煙草合子中克隆到1種新型的未知功能基因NtZE583，編碼包含有91個氨基酸殘基的多肽鏈。生物信息學分析顯示：該蛋白的N端含有1段疏水性信號肽，但在其他物種中沒有發現同類蛋白。NtZE583-綠色熒光蛋白（NtZE583-GFP）融合蛋白亞細胞定位顯示，該蛋白可能存在于液泡中。利用染色體步移技術獲得該基因5′端上游3 866 bp的側翼序列（啟動子和5′UTR），經檢測發現，具有較強的啟動子活性。研究結果為進一步研究該基因在煙草早期胚胎發生中的功能奠定了基礎。

關鍵詞：煙草；合子；液泡；基因克隆；信號肽

中圖分類號： S572.01；Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0065-04

被子植物的受精過程被稱為雙受精，即來自同一花粉的2個精子同時進入胚囊，1個與卵細胞結合形成二倍體的合子，另2個與中央細胞結合形成三倍體的胚乳母細胞。受精完成后，胚胎逐漸形成基本的形態和生理結構[1]，而胚乳則在此過程中扮演支持者的角色[2-3]。

對于受精和早期胚胎發生過程的分子機制在動物中研究得比較深入，但是在植物中由于技術手段的限制導致對這方面的認識一直有許多空白。因為植物的受精和胚胎發生過程都存在于深埋在植物孢子體內的胚囊中，所以很難對整個過程直接進行觀察并了解背后的分子機制。隨著現代生物學技術的發展，目前已能獲得玉米、擬南芥、大米、大麥等一些植物的配子、合子和早期胚胎；此外，這些植物中與生殖發育息息相關的細胞cDNA文庫、轉錄譜等也已陸續獲得[4-7]。這些進展對于研究植物的受精和胚胎發生過程起到了推動作用。

為了探索受精和早期胚胎發生的分子機制，特別是早期胚胎發生中的表觀調控機制、合子不等分裂、細胞間通信等重大問題，筆者所在實驗室用前期建立的胚胎分離技術[8-9]和SMARTTM cDNA library construction試劑盒構建了煙草合子和卵細胞的cDNA差減文庫，通過篩選獲得了許多在合子時期特異表達的基因[10]。對其中1個具有信號肽結構的未知基因NtZE583進行克隆和染色體步移，獲得了其完整CDS序列和有活性的5′側翼調控序列，為進一步利用基因敲除和過表達技術來研究其在煙草早期胚胎發育中的作用打下基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株與質粒綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白表達載體，GFP核定位表達載體在pART27載體上改造而成，由武漢大學彭雄波副教授提供。大腸桿菌DH5α感受態為筆者所在實驗室自制。

1.1.2植物材料試驗材料為野生型煙草（Nicotiana tabacum var. SR1），種植于長江大學生命科學學院所屬溫室內，室溫25 ℃，光照時間16 h。

1.1.3主要試劑普通DNA片段回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司）；Universal Genome Walker Kit（Clontech公司）；DNA聚合酶Ex Taq（TaKaRa公司）；DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerasehe、限制性內切酶（NEB公司）；T4 DNA lignase（Fermentas公司）；Dynalbeads mRNA DIRECT Micro Kit（Life technologies公司）；SMARTerPico PCR cDNA Synthesis Kit（Life technologies公司）。

1.2試驗方法

1.2.1煙草genome walking文庫的構建和NtZE583基因5′ 側翼區的克隆取煙草幼葉，按照DNeasy Plant Mini試劑盒的要求提取DNA。用UniversalGenomeWalker試劑盒構建genome walking 文庫，檢測合格后按照試劑盒要求設計GSP引物。反應體系和反應條件參照試劑盒要求，引物退火溫度靈活掌握，得到目的片段后送樣測序，引物序列詳見表1。

1.2.2煙草合子的分離與少量細胞RT-PCR用酶解-研磨法分離得到50個煙草合子[8-9]。按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro試劑盒的說明分離出合子的mRNA，并使用SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis試劑盒制成合子cDNA庫。在已知EST序列2端設計檢測引物擴增 NtZE583 基因CDS序列，擴增產物經電泳檢測正確后送樣測序，引物序列詳見表2。

1.2.3NtZE583-EGFP融合蛋白和EGFP核定位表達載體的構建依據已知序列，分別設計用于擴增NtZE583基因的5′ 側翼區和CDS的引物，并在5′端添加酶切位點，引物序列見表3。用CDS-F2/CDS-R2引物，在煙草合子cDNA庫中擴增CDS序列；用PRO-F/PRO-R在煙草基因組中擴增NtZE583基因側翼序列（啟動子和5′UTR）。對目的條帶回收后進行雙酶切，并分別連入NtZE583-GFP融合蛋白表達載體、GFP核定位表達載體。

表3載體構建所需引物

1.2.4NtZE583-GFP融合蛋白亞細胞定位和NtZE583啟動子活性的觀察應用基因槍法將構建好的NtZE583-GFP融合蛋白表達載體和EGFP核定位表達載體轉導入洋蔥表皮細胞，培養24 h后用普通熒光顯微鏡觀察。

1.2.5生物信息學分析用Omiga分析EST序列的開放閱讀框。用Protparam、ProtScale軟件預測蛋白質的氨基酸組成和理論等電點等基本理化性質，并通過SOPMA軟件預測其二級結構。分別用PSORT、SignalP軟件預測蛋白質的亞細胞定位和信號肽。

2結果與分析

2.1煙草早期胚胎的分離

植物的胚胎發育過程發生在母體組織中。由于母本組織的干擾，通常難以有效地獲取正在發育的胚胎細胞。目前通過酶解和顯微操作已經能夠精確地分離出煙草SR1胚珠中合子發育時期的胚囊（圖1-A）。合子為胚囊細胞所包裹，必須進行2次酶解和顯微操作才能獲得未附帶母體組織的完整的合子（圖1-B）。圖1結果顯示：經過酶解和顯微操作分離后的合子形態正常，背景清晰無雜質，這說明分離的合子狀態良好且無母體組織污染，可以用于后續少量細胞mRNA的提取和cDNA庫的制作。

2.2NtZE583基因在合子中的檢測

根據筆者所在實驗室之前獲得的煙草合子cDNA 文庫信息，已知煙草合子中存在NtZE583基因的表達。NtZE583基因EST序列長度為449 bp，Omega軟件分析顯示，該基因擁有1個273 bp的開放閱讀框，可以在合子cDNA庫中得到擴增（圖2）。經過NCBI數據比對發現，尚無類似基因存在于其他物種中，表明NtZE583基因屬于1個未知功能的、在早期胚胎發育時期表達的新型基因。

2.3NtZE583蛋白一級結構預測分析

運用軟件對NtZE583蛋白進行生物信息學分析，結果顯示：NtZE583蛋白的分子量為9.785 3 ku，理論等電點為 8.46，屬于堿性蛋白。該蛋白多肽鏈包含91個氨基酸殘基，含18 種基本氨基酸類型，不含組氨酸、色氨酸，其中絲氨酸含量最高，占16.5%。氨基酸一級結構預測分析表明：NtZE583蛋白擁有8個正電荷殘基、5個負電荷殘基，該蛋白脂肪系數為72.86，不穩定性指數為50.07，平均總疏水性為0.286，預測為疏水性蛋白，且不太穩定（表4）。

2.4NtZE583蛋白二級結構的預測

蛋白質多肽鏈自身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構象稱為蛋白質二級結構，α-螺旋、β-轉角等屬于蛋白質的基本二級結構。正確的二級結構有助于蛋白質正常履表4NtZE583基因編碼的氨基酸一級結構預測分析結果行其在細胞生命活動中的功能。 軟件分析顯示，NtZE583蛋白的二級結構有3種形式，分別為α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈，分別占18.68%、52.75%、28.57%）。圖3結果顯示，無規則卷曲這類二級結構在NtZE583蛋白中最多，α-螺旋主要集中在蛋白的N端，而延伸鏈則在蛋白中零星分布（表5、圖3）。

2.5NtZE583蛋白信號肽的預測與蛋白亞細胞定位的分析

用Psort軟件對NtZE583蛋白亞細胞分布進行預測，發現最可能分布在膜外。同時用ProtScale軟件預測NtZE583蛋白N端的氨基酸發現，其具有較強的疏水性；用SignalP軟件預測NtZE583蛋白發現可能存在信號肽，并在第24、第25個氨基酸之間剪切（圖4）。為了進一步分析NtZE583蛋白的亞細胞定位，采用融合蛋白載體瞬時轉化洋蔥表皮細胞。由圖5可以看出：35S啟動子驅動的GFP蛋白在細胞中均勻分布，而35S啟動子驅動的NtZE583-GFP融合蛋白則主要分布在細胞質的液泡中，暗示NtZE583蛋白的亞細胞定位受其N端的信號肽控制。

2.6NtZE583基因的5′側翼序列在早期胚胎時期的活性

以EST序列為基礎，通過染色體步移技術共獲得NtZE583基因起始密碼子ATG前共3 866 bp的側翼序列。為驗證其啟動活性，擴增了其中的2 725 bp（包括部分啟動子、全部5′UTR序列）接入GFP核定位載體，采用基因槍將載體注射入洋蔥表皮細胞中進行觀察。熒光顯微鏡中可以看到，洋蔥表皮細胞的細胞核中有清晰可辨的綠色熒光（圖6），表明所獲基因的5′側翼序列確實具有較強的啟動子活性。

3討論

在煙草合子中表達的NtZE583基因含有273 bp的CDS區，其編碼的蛋白質作為一種未知功能的新型蛋白，在NCBI數據庫收錄的雙子葉和單子葉植物的基因信息中均未發現，其可能在煙草合子的發育過程中起著某種獨特的作用。對新獲得的NtZE583蛋白序列進行分析表明，該蛋白具有信號肽；將NtZE583蛋白與GFP蛋白融合后在洋蔥表皮細胞中觀察其亞細胞定位，發現它極有可能定位于細胞的液泡中。

植物細胞相對于動物細胞而言，普遍含有液泡這一特殊的細胞器[11-13]。液泡由單層質膜包圍而成并充滿液體，與植物細胞的各種重要的生命活動息息相關，如參與細胞滲透壓和膨壓的維持與調節、幫助穩定細胞內pH值、消除由某些有毒物質導致的毒害作用、存儲營養物質及其多種代謝產物、保證細胞生物合成原料的穩定供應等。

NtZE583基因的發現表明，在煙草合子的發育過程中有一種獨特的未知功能的蛋白存在于液泡中并發揮了重要作用。本研究利用染色體步移技術對NtZE583基因的5′側翼序列進行了克隆，將包括啟動子、5′UTR區的序列連接GFP后瞬時轉化洋蔥表皮細胞，能觀察到極強的綠色熒光。說明獲得的表達調控序列具有較強的啟動子活性，為今后使用RNA干擾（RNAi）和過表達等基因功能分析手段對NtZE583基因在合子發育中的功能進行研究提供了幫助，將豐富我們對植物早期胚胎發生過程中的分子調控機制的認識。

4結論

本試驗成功克隆了煙草合子表達基因NtZE583，并獲得了具有啟動子活性的5′側翼序列，為闡明NtZE583基因參與早期胚胎發生的機制奠定了基礎。

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