HPLC法測定桉芩止咳糖漿中黃芩苷及其不確定度評定

劉立民，侯雄軍，湯韶明，甘曉云，劉　玲，張五萍

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

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HPLC法測定桉芩止咳糖漿中黃芩苷及其不確定度評定

劉立民，侯雄軍，湯韶明，甘曉云，劉玲，張五萍

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

[摘要]目的建立桉芩止咳糖漿中黃芩苷的HPLC測定方法，并對所建立方法進行不確定度評定。方法采用HPLC法測定桉芩止咳糖漿中黃芩苷的含量，再根據(jù)方法學驗證數(shù)據(jù)，對測定過程中引入的不確定度進行評定，并計算合成不確定度，最終計算出測量結果在95%置信區(qū)間下的擴展不確定度。結果采用本方法測定桉芩止咳糖漿中黃芩苷含量的擴展不確定度為2.16%。結論綜合不確定度評定，可使測定結果更為準確可靠，可用于桉芩止咳糖漿的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]桉芩止咳糖漿；黃芩苷；不確定度；高效液相色譜法

桉芩止咳糖漿為我院治療因外感風熱、熱郁肺經(jīng)、肺失宣肅所致的咳嗽、咳痰、痰黃或白、喘息等疾病的醫(yī)院制劑，由桉葉、黃芩、枇杷葉、麻黃、百部、桔梗六味中藥組成。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主要含黃芩苷、黃芩素等黃酮類化合物，是桉芩止咳糖漿發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎[1-3]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相關聯(lián)的參數(shù)。由于結果測量定量表征是通過測量不確定度進行的，中國合格評定認可委員會(CNAL)對實驗室認可時候均需開展對測量不確定度的評定[4]。本實驗對所建立的含量測定方法進行方法學驗證的同時，根據(jù)中國實驗室國家認可委員會頒布的《分析測量中不確定度的評定》[5]，并參考文獻[6-8]定量測定不確定度評定方法，對桉芩止咳糖漿中黃芩苷的測定結果進行不確定度評定研究，建立了一套合理、完善的桉葉止咳糖漿的質(zhì)量評價方法。

1儀器與試藥

島津LC-2010A高效液相色譜儀； Diamonsil C18色譜柱(250x4.6mm，5 μm)；KQ118超聲波清洗器；ACS型電子計價天平；AE240萬分之一電子分析天平；Sartorius BP211D十萬分之一電子分析天平。

黃芩苷(批號：110715-200514，供含測用，中國藥品生物制品檢定所)；實驗所用藥材購自江西江中武寧中藥有限公司。乙腈(色譜純，西隴化工股份有限公司)、甲醇(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)、二級純化水(本院制劑室提供)，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1黃芩苷的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備稱取干燥恒重過的黃芩苷對照品0.004 12 g，轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得0.4120 mg/mL的黃芩苷對照品溶液，然后將其稀釋成濃度為0.309 0，0.206 0，0.103 0，0.051 5，0.025 8，0.012 9，0.006 4 mg/mL的黃芩苷對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備精密量取桉芩止咳糖漿10 mL，用純化水稀釋至200 mL，超聲，混勻。取稀釋液1 mL，轉移至10 mL的容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，超聲，混勻，取稀釋液適量，用0.45 μm微孔濾頭過濾，即得。

2.1.3陰性對照溶液的制備取處方中缺黃芩藥材的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得缺黃芩陰性對照供試品溶液。

2.1.4色譜條件色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水=23∶77；檢測波長：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.5系統(tǒng)適用性試驗取黃芩苷對照品溶液，供試品溶液，陰性對照溶液，注入HPLC色譜儀，按“2.1.4”項下色譜條件檢測，結果供試品溶液中黃芩苷得到很好的分離，峰型對稱性較好，且陰性無干擾，理論塔板數(shù)以黃芩苷計大于2 500，表明此條件適用于供試品中黃芩苷的檢測，見圖1。

A：黃芩苷對照品溶液(0.103 0 mg/mL)；B：供試品溶液；C：缺黃芩陰性對照圖1　黃芩苷HPLC圖

2.1.6線性關系考察精密吸取稀釋好的黃芩苷對照品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件測定。以黃芩苷濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。得回歸方程：y=31 335 371.8x+36 068.5(R2=1.000 0，n=8)，表明黃芩苷濃度在0.006 4～0.412 0 mg/mL之間具有很好的線性關系。

2.1.7方法學考察

2.1.7.1精密度試驗精密吸取黃芩苷對照品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件測定，重復進樣6次，測得黃芩苷平均峰面積為3 299 547，RSD為0.26%，表明儀器精密度較高。

2.1.7.2穩(wěn)定性試驗按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0,1,2,4,8,12 h各進樣一次，按“2.1.4”項下色譜條件測定，測得黃芩苷平均峰面積為3 820 700，RSD為0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7.3重復性試驗按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.4”項下色譜條件測定，測得黃芩苷平均峰面積為3 804 035，RSD為1.53%，表明該法重現(xiàn)性較好。

2.1.7.4加樣回收率試驗 精密移取同一批桉芩止咳糖漿(黃芩苷含量為24.371 2 mg/mL)，6份，每份10 mL，用純化水稀釋至200 mL，超聲，混勻。取稀釋液1 mL，轉移至10 mL的容量瓶中，精密加入濃度為1.214 0 mg/mL黃芩苷對照品溶液1.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，超聲，混勻，取稀釋液適量，用0.45 μm微孔濾頭過濾，按“2.1.4”項下色譜條件測定，計算回收率，結果平均回收率為98.41，RSD為1.81%，表明該法回收率較高。見表1。

表1　黃芩苷加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2不確定度評價

2.2.1不確定來源分析本實驗中不確定度的主要來源為測量過程中的對照品和樣品的體積引入不確定度、質(zhì)量不確定度、樣品回收率所導致的不確定度以及液相測試過程中隨機效應所帶來的不確定度。因此，可采用重復性研究數(shù)據(jù)以及實驗準確度的回收率實驗數(shù)據(jù)，將涵蓋所有樣品制備與檢測過程中的隨機效應以及儀器操作、樣品基質(zhì)等因素的系統(tǒng)誤差所引起的不確定度進行評定。

2.2.2不確定度分量量化

表2　標準溶液配制的相對不確定度

表3　準確度的不確定度評定

2.2.2.4擴展不確定度及報告不確定度95%置信概率下取包含因子κ=2，則相對擴展不確定度U95(W)=κ×Ucrel(W)=2×0.010 8=2.16%。實驗所測批號140915桉芩止咳糖漿的黃芩苷含量W=24.13 mg/mL，故其擴展不確定度為：U95=24.13×0.021 6=0.521 3 mg/mL，其他批次的擴展不確定度見表4。

3討論

本實驗以桉芩止咳糖漿為研究對象，建立其有效成分黃芩苷的定量測定方法，根據(jù)《中國藥典》規(guī)定，方法學驗證的內(nèi)容有準確度、精密度等，但這些試驗并未對實驗具體測定結果的可信度進行量化。本實驗根據(jù)不確定度理論對方法的重復性及回收率試驗進行不確定度評定，并在 95%的置信區(qū)間下，得出本方法所測質(zhì)量分數(shù)結果的擴展不確定度為(W×2.16%)mg/mL，定量描述實驗方法的可信度，可作為桉芩止咳糖漿中黃芩苷定量測定方法學驗證的一種補充。

表4　桉芩止咳糖漿中黃芩苷含量測定結果(n=3,mg/mL)

在藥物分析檢測評定不確定度時，應盡可能地分析產(chǎn)生不確定度的所有可能來源。目前，分析測試領域中多采用對每個測定步驟進行分析，從而得出對測定結果的不確定度。但是由于化學分析操作相對較為復雜，需附加實驗后再進行B類不確定度的評定，而且其測定過程中對A類不確定度也較難評定，本文通過實驗室內(nèi)部方法學驗證法(Validation-based法)的數(shù)據(jù)進行評定，通過采用方法學考察的準確度與精密度實驗，從而進行整體考察檢測方法的不確定度，此法適合于中藥分析中的實際應用。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.036

[中圖分類號]R965.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)19-2152-03

[通信作者]侯雄軍，E-mail：66928053@qq.com

[基金項目]江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金項目(2013A047)

[收稿日期]2016-02-15