HPLC梯度洗脫同步測定瀘州產梔子主要有效成分梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的含量

黃群蓮，王利國，唐　燦，黃　易，黃愛玲，孫　琳

(1. 西南醫科大學附屬醫院，四川 瀘州646000；2. 西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；3. 西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000)

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藥物研究

HPLC梯度洗脫同步測定瀘州產梔子主要有效成分梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的含量

黃群蓮1，王利國2，唐燦3，黃易3，黃愛玲3，孫琳3

(1. 西南醫科大學附屬醫院，四川 瀘州646000；2. 西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；3. 西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000)

[摘要]目的建立HPLC梯度洗脫同步測定瀘州產梔子中梔子苷和西紅花苷-Ⅰ含量的測定方法。方法采用高效液相色譜法，使用20RBAX SB-C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水溶液為流動相梯度洗脫：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min，流速1 mL/min，變波長檢測:0～30 min，238 nm，30～60 min，440 nm，柱溫35 ℃。結果瀘州產梔子中梔子苷質量分數均在31.7 mg/g以上，西紅花苷-Ⅰ均在5.58 mg/g以上。梔子苷的積分面積A與進樣量M線性回歸方程為A=1 963.231M+9.151 108(r2=0.999 991)，進樣量在0.132 5～10.6 μg范圍內線性關系良好。西紅花苷-Ⅰ積分面積A與進樣M線性回歸方程A=4 539.579M+14.504 24(r2=0.999 991)，進樣量在0.021～1.68 μg范圍內線性關系良好。結論該方法分離良好，測定準確，重復性好，可同時測定梔子中梔子苷和西紅花苷-Ⅰ兩種有效成分,為全面控制瀘州產梔子質量提供了可靠的科學依據。

[關鍵詞]梔子;梔子苷;西紅花苷-Ⅰ;高效液相色譜;梯度洗脫

瀘州地理位置優越，氣候溫和，四季分明，氣候適宜作物生長[1-2]，中藥材極為豐富，是四川省重點藥材產區之一，素有“藥材之鄉”的美稱。中藥材資源主要品種有趕黃草、黃梔子、石斛、青果、青蒿、黃柏、杜仲、天麻等[3]。 梔子(Gardenia jasminoides Eillis)見于《神農本草經》，是茜草科(Rubiacece)梔子屬(Gardenia)的一種常綠灌木的果實，具有清熱除煩、涼血解毒之功效，是生產“清開靈”“安宮牛黃丸”“龍膽瀉肝丸”“清熱解毒顆粒”[4]“茵梔黃注射液”等中成藥的重要原料。國內梔子藥材資源豐富，但多數為野生資源，缺乏規范的管理[5]。目前市場上流通的梔子藥材，因受產地來源、采收時間、儲藏時間及基原植物的影響，質量參差不齊。在梔子藥材的質量控制指標中，2010年版《中國藥典》一部僅規定了測定梔子苷的含量，然而梔子苷并非梔子藥材的唯一有效成分[6]。梔子在醫療、保健、食品等方面應用較廣，因此僅將梔子苷作為質量評價的唯一指標顯然不夠，還應將具有顯著藥理作用及應用價值的色素類成分如西紅花苷-Ⅰ也列為質量評價指標。而通過測定瀘州產梔子主要有效成分梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的含量,能指導藥農科學種植梔子，提高瀘州產梔子藥材的品質和規模，形成規范化大規模梔子GAP種植基地，為地方中藥企業提供優質梔子原藥材，促進瀘州經濟發展。

1試驗材料與儀器

1.1試驗材料

1.1.1試驗藥材野生及個體戶種植的梔子，采自瀘州納溪區和龍馬潭區，經課題組鑒定均為茜草科植物梔子(Gardenia gasminoides Ellis)和水梔子(G.jaminoides Ellis.f.logica-rpa Z.W. Xie et OKada)的干燥成熟果實。采集后進行干燥，研磨成粗粉，備用。

1.1.2藥品與試劑梔子苷(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，約20 mg,批號 ：110742-200516);西紅花苷-I(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，約20 mg,批號:111588-00501);乙腈(色譜純，上海星可生化有限公司);甲醇(分析醇，四川西隴化工有限公司);80%甲醇:量取甲醇160 mL,蒸餾水40 mL,配制成80%甲醇200 mL;蒸餾水(西南醫科大學附屬醫院藥劑科);無水乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司)。

1.2試驗儀器高效液相色譜儀(型號為Agilent Q60);20RBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,Agilent Technologies);電子天平(FA1104N型,上海民橋精密科學儀器有限公司);超聲震蕩儀(AS2060B型,天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。2 mL透明帶刻度螺旋口樣品瓶,11.6×32 mm,5.0玻璃(適合安捷倫HPLC);紅色特氟龍/白色硅膠隔墊，Φ9 mm×1 mm;藍色開口聚丙烯蓋，Φ9 mm,中心孔徑6 mm;GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司);T-50砂芯過濾裝置抽濾裝置(1 000 mL)天津市津騰實驗設備有限公司);一次性針頭式濾器水系混合纖維素膜25 mm×0.22 μm；微孔濾膜水系濾膜(Ф50 mm×3 μm,50片/盒,上海新亞有限公司)。

2試驗方法

2.1預前處理

2.1.1樣品的處理將采集到的梔子逐一先按產地，再按紅果、黃果、綠果進行分類。將分類好的梔子豎切成兩半，放入烘干箱中調至50 ℃進行烘干[7]。記錄樣品編號如表1。

表1　梔子樣品來源

2.1.2供試品溶液的制備取干燥后的梔子用鐵研錘進行研磨，過16號篩。分別稱取各地待測梔子樣品，粉末質量見表2。將稱取好的梔子粉末，分別置于150 mL錐形瓶中，用移液管精密加入80%甲醇40 mL超聲2 h。將錐形瓶拿出來放涼，搖勻，放置，然后用漏斗過濾，得到供試品溶液。用翻口瓶進行密封，放于冰箱冷藏室中保存，并貼好標簽。取適量供試品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得待試溶液。

表2　各地梔子稱取質量

2.1.3對照品溶液的制備對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品5.3 mg,置于5 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得1.06 mg/mL梔子苷對照品；精密稱取西紅花苷-I對照品4.20 mg,置于25 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得0.168 mg/mL西紅花苷-I對照品溶液[8]。

2.2色譜條件色譜柱：20RBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相：乙腈-水溶液，梯度洗脫：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min,乙腈10%→18%→28%→38%→50%→10%;檢測波長：0～30 min,238 nm,30～60 min,440 nm;柱溫35 ℃；流速1 mL/min;進樣量5 μL[9]。

2.3色譜系統適用性試驗以梔子苷、西紅花苷-Ⅰ峰計算，測得理論塔板數分別為28 765，724 792。梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和前后的色譜峰達到基線分離,對稱因子分別為0.67，0.68，峰形基本對稱。在測定時比較穩定，峰面積也較大，因此二者可以選作參照物峰。見圖1及圖2。

圖1　梔子苷對照品HPLC色譜圖

圖2　西紅花苷-Ⅰ對照品HPLC色譜圖

2.4線性關系考察精密稱取標準品10.6 mg置于10 mL容量瓶中,加80%甲醇至刻度，精密量取5 mL梔子苷對照品溶液，5 mL西紅花苷對照品，置于10 mL容量瓶中備用。對照品溶液進樣量:濃度不變，雙重進樣時依次按0.3,0.5,1,2,5,8,16,20 μL分別注入液相色譜儀，按 2.3項下的色譜條件進行測定。結果見表3。以對照品進樣量(g)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。梔子苷積分面積A與進樣量M線性回歸方程:A=1 963.231M+9.151 108,r2=0.999 991,進樣量在0.132 5～10.6 μg范圍內線性關系良好,見圖3。西紅花苷-Ⅰ積分面積A與進樣量M線性回歸方程：A=4 539.579M+14.504 24，r2=0.999 991，進樣量在0.021～1.68 μg范圍內線性關系良好，見圖4。

3結果

對照品以及各地采集的梔子供試品HPLC圖譜見圖5～13。根據供試品HPLC圖譜峰面積計算各得測品含量，結果見表4及表5。

4討論

《中國藥典》2010版一部載有梔子苷HPLC含量測定方法。梔子苷的含量是藥用梔子優選中的一個很重要的指標，但現代藥理實驗證明，中藥材是個復雜體系，僅將梔子苷作為梔子的質量評價指標是不夠的，很有必要將其中具有顯著抗炎活性的有機酸類物質及具有明顯降血脂及抗腫瘤作用的西紅花苷類的測定作為梔子藥材質量評價指標之一[10]。

表3　線性關系考察結果

圖3　梔子苷對照品標準曲線圖

圖4　西紅花苷-Ⅰ對照品標準曲線圖

圖5　NX1樣品圖HPLC色譜圖

圖6　NX2樣品HPLC色譜圖

圖7　NX3樣品HPLC色譜圖

圖8　NX6樣品HPLC色譜圖

圖9　NX7樣品HPLC色譜圖

圖10　QL1樣品HPLC色譜圖

圖11　QL4樣品HPLC色譜圖

圖12　QL5樣品HPLC色譜圖

圖13　BZ3樣品HPLC色譜圖表4　西紅花苷-I的檢測結果統計表

編號藥材質量/g西紅花苷-Ⅰ面積西紅花苷-Ⅰ進樣量/μg西紅花苷-Ⅰ濃度/(μg/μL)西紅花苷-Ⅰ質量分數/(mg/g)NX15.046411270.70.88980.17807.0526NX25.000412292.10.97050.19417.7630NX35.016310542.00.83220.16646.6356NX65.076512040.00.95060.19017.4899NX75.055011894.80.93910.18787.4309QL15.004513814.71.09080.21828.7189QL45.031012690.71.00200.20047.9666QL55.07298972.30.70810.14165.5832BZ30.943613524.61.06790.21369.0539

表5　梔子苷的檢測結果

梔子黃色素的主要成分為以西紅花苷-Ⅰ為主的西紅花苷類成分，具有利膽、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[11]。在試驗過程中，西紅花苷-I的重復性試驗，檢測出的結果差異較大。經分析，可能是因為試驗過程中沒有注意避光保存，樣品在日光照射下發生了化學反應，應注意取樣后及時將其避光保存。此外，在本次試驗中梔子超聲震蕩提取前未進行浸泡，可能會降低提取的有效成分含量。

從本研究結果可知，NX3、QL5這兩個綠果期的西紅花苷-Ⅰ含量比其他的樣品低，而梔子苷的含量比較高。而紅熟期梔子NX6、QL1、BZ3梔子苷峰面積依次下降，此時西紅花苷-Ⅰ含量均比黃果和青果時期的含量高。

山梔子是傳統中藥，有瀉火除煩、涼血散瘀的功效，在臨床中應用甚廣。水梔子主要作為工業和食品的黃色天然著色原料。兩者所含的環烯醚萜苷類成分之一梔子苷(geniposide)為有效成分，水梔子果實大，產量高，易于栽培管理[12]。通過測定和比較二者所含梔子苷的不同，可以推斷水梔子是否能作為一種傳統中藥材的代用品。

本試驗中提取后的樣品溶液雖放入翻口瓶中密封，并置于冰箱中冷藏保存。但由于試驗的時間較長，瓶中溶液出現了不同程度的結晶。經查閱文獻，由于梔子黃色素在冷藏過程中容易產生沉淀。其產生沉淀的原因主要是2價和3價金屬離子特別是Ca2+的存在容易引起溶液中部分成分的聚沉[12]。在本次試驗中采用的處理方法是用超聲震蕩儀進行短時間的震蕩以除去沉淀，肉眼見均一的澄清溶液。

試驗中使用的梯度洗脫方法是參照王子雯等[9]2013年發表的“巴中產梔子不同采收期指紋圖譜的比較研究”所實踐過的方法。但在試驗過程中，幾次出現柱壓過高導致的儀器停止運行的情況，可能是儀器老化導致，或是因為過濾系統的清洗不夠徹底。本研究中嘗試將常用型號的0.45 μm過濾頭換成了0.22 μm的過濾頭，增加預柱以排除干擾。

文中建立的RP-HPLC法，利用紫外檢測器，通過HPLC 系統中的操作軟件進行程序設定，采用變波長、梯度洗脫的方法，在同一色譜條件下能夠同時檢測梔子中的梔子苷類和西紅花苷-Ⅰ成分，由HPLC圖譜可看出供試品中各組分與其他組分均能達到基線分離，且基線平穩。該方法簡便，重復性好，比現行藥典方法更能全面客觀地反映梔子藥材質量，在梔子內在成分含量測定上具有一定的創新性，可為提高梔子質量控制方法提供參考。

該地梔子藥材梔子苷的質量分數均在31.7 mg/g以上，平均質量分數為46.5 mg/g，說明瀘州地區梔子藥材所含化學成分隨產地的變化小，產區梔子質量優良。梔子苷含量均高于藥典的要求(18 mg/g)，符合國家藥用標準。

西紅花苷-Ⅰ濃度最低為5.6 mg/g, 最高達9.1 mg/g, 含量相差近一倍。作為提取西紅花苷類色素的原料,同一產區的梔子也應有所選擇。梔子苷與西紅花苷-Ⅰ含量無明顯關系。

經本研究數據分析結果可以看出，以梔子提取梔子苷入藥，則以青果期梔子為佳。但若要提取西紅花苷-I或主要以西紅花苷-I入藥，則以紅熟期梔子更好[14]。

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[通信作者]唐燦，E-mail：Tang9670625@163.com

[基金項目]四川省科技廳聯合專項項目(14ZC0045)；瀘州市政府聯合專項項目(2013LZLY-K69)；四川省科技支撐計劃項目(2011SZ0048)；四川省科技支撐計劃項目(2010SZ0049)；四川省教育廳重點科研項目(2005A071)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.035

[中圖分類號]R965.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)19-2148-05

[收稿日期]2015-12-15