黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響

沈玉玨

(河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

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黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響

沈玉玨

(河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的研究黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響，并探討其可能作用機制。方法分離并培養乳鼠心肌細胞72 h后分為空白對照組、H2O2組、黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組、黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組、黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組，每組設10個復孔。每組給予相應干預24 h后，采用MTT法檢測細胞存活率，采用紫外-可見分光光度計檢測細胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)]活性，采用氧敏感熒光探針DCFH-DA檢測氧自由基(ROS)含量，采用全自動生化分析儀檢測培養液中心肌酶[谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)]和丙二醛(MDA)含量，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況并計算凋亡率，采用免疫印跡法檢測細胞核因子-κB(NF-κB)蛋白表達情況并進行半定量分析。結果與H2O2組比較，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞存活率及細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高(P均<0.05)，ROS含量顯著降低(P<0.05)，培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量及細胞凋亡率、NF-kB蛋白表達量均顯著降低(P均<0.05)；黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞存活率及細胞中SOD、GSH-Px活性均顯著高于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P均<0.05)，CPK、MDA含量及細胞凋亡率、細胞中NF-κB蛋白表達量均顯著低于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P均<0.05)。結論黃芪多糖可能通過提高心肌細胞存活率、改善抗氧化酶活性、提高ROS清除能力、降低心肌酶含量、抑制細胞凋亡、下調NF-kB蛋白表達而對H2O2誘導乳鼠心肌細胞氧化應激損傷起保護作用，且高劑量效果更好。

[關鍵詞]黃芪多糖；H2O2；心肌細胞；氧化應激

心肌細胞缺血再灌注損傷是影響急性心肌梗死患者溶栓、介入手術等手段治療效果的重要因素之一，其病理機制非常復雜，其中氧化應激損傷是最重要的病理基礎之一[1]，為研發抑制缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。黃芪多糖是我國傳統中藥黃芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種藥理學作用[2-5]。本研究觀察了黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響，并探討了其可能作用機制，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1藥物與試劑黃芪多糖，西安沃森生物科技有限公司，批號：20131205； DMEM培養基、胎牛血清，美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)、甲基四唑藍(MTT，美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；氧自由基(ROS) 檢測試劑盒、AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞核因子-κB(NF-κB)單克隆抗體，碧云天生物技術有限公司。

1.2實驗動物清潔級雄性SD乳鼠(1～3 d)，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物合格證號：150314012。

1.3主要儀器SW-4T-2F潔凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠； NU-4850E型CO2培養箱，美國Nu Aire公司；VCX750型超聲波細胞破碎儀，美國SONICS公司；UV762型紫外-可見分光光度計，上海楚定分析儀器有限公司；BS-300型全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；iMark型酶標儀、FACS Aria型流式細胞儀，美國BD公司；DYY-11 型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽，北京六一儀器廠。

1.4乳鼠心肌細胞的分離、培養與分組參照文獻[6]方法，無菌環境下開胸取心臟并剪取心室組織，剪碎，加入0.1%胰酶后于37 ℃振蕩消化6 min，去上清、沉淀，繼續用0.1%胰酶于37 ℃振蕩消化6 min，如此循環直至組織碎塊消化完畢，收集消化上清液，1 500 r/min離心10 min，取沉淀，加入心肌細胞培養基(10%胎牛血清 DMEM，內含105IU/L的青霉素和鏈霉素)，吹打均勻，壁立 1.5 h。收集未貼壁細胞，調整細胞至 6×108L-1，接種于35 mm培養器皿中，37 ℃、5% CO2、100%濕度培養72 h后，將狀態良好的原代乳鼠心肌細胞隨機分為空白對照組、H2O2(200 μmol/L)組、黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組、黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組、黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組，每組設10個復孔，給予相應干預。

1.5檢測指標

1.5.1細胞存活率干預24 h后，將細胞接種于96孔培養板(n=6)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩15 min，通過酶標儀檢測490 nm處OD值，然后計算細胞存活率：細胞存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.5.2細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性干預24 h后，棄培養基取細胞，每孔加入2 mL PBS溶液后冰浴中破碎處理30 s，低溫離心取上清液，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組細胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.5.3細胞中ROS含量去培養液，加入氧敏感熒光探針DCFH-DA(10 μmol/L)，置于細胞培養箱內孵育20 min后，經無血清細胞培養液沖洗3次，然后通過熒光顯微鏡和流式細胞儀進行檢測。

1.5.4培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量干預24 h后，分別取各組培養液并按照各試劑盒操作方法進行處理，然后通過全自動生化分析儀平行測定各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量，并紫外-可見分光光度計測定各組培養液中MDA含量。

1.5.5細胞凋亡情況及細胞凋亡率干預24 h后，使用0.25%胰酶進行消化，離心棄上清液，經PBS溶液沖洗2次后，按照AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作方法步驟依次進行處理，避光孵育10 min后采用流式細胞儀檢測，觀察各組細胞凋亡狀況并在流式二維圖中計算凋亡率。

1.5.6細胞中NF-κB蛋白表達情況取1.5.2制備的細胞裂解提取液，經12 000 r/min低溫離心10 min后取沉淀，行BCA法蛋白定量，變性后上樣，經電泳、轉膜、春紅溶液染色后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃過夜；洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

1.6統計學方法運用軟件SPSS 17.0進行統計分析。計量資料用表示，組間均數比較采用One-way ANOVA進行分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1各組心肌細胞存活率比較空白對照組心肌細胞存活率為(96.8±4.6)%，H2O2組為(45.1±5.9)%，黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組為(50.7±6.8)%，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組為(68.4±7.5)%，黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組為(84.0±10.3)%。H2O2組乳鼠心肌細胞存活率明顯低于空白對照(P<0.05)；黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞存活率明顯高于H2O2組(P<0.05)，黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞存活率明顯高于黃芪多糖40 μmol/L+ H2O2組(P<0.05)。

2.2各組心肌細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性比較H2O2組心肌細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著低于空白對照組(P均<0.05)；黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著高于H2O2組(P均<0.05)；黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組SOD、GSH-Px活性顯著高于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P均<0.05)，而2組間CAT活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組心肌細胞中SOD、GSH-Px、CAT

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與H2O2組比較，P<0.05；③與黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組比較，P<0.05。

2.3各組心肌細胞中ROS含量比較通過氧敏感熒光探針DCFH-DA檢測及流式細胞儀進行分析發現，H2O2組ROS含量明顯高于空白對照組；經黃芪多糖干預24 h后，H2O2誘導損傷乳鼠心肌細胞ROS含量明顯低于H2O2組。見圖1～10。

圖1　DCFH-DA檢測空白對照組心肌細胞ROS含量

圖2　DCFH-DA檢測H2O2組心肌細胞ROS含量

圖3　DCFH-DA檢測黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量

圖4　DCFH-DA檢測黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量

圖5　DCFH-DA檢測黃芪多糖 80 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量

圖6　空白對照組心肌細胞ROS含量(流式細胞儀)

圖7　H2O2組心肌細胞ROS含量(流式細胞儀)

2.4各組心肌細胞培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量比較H2O2組心肌細胞培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量均顯著高于空白對照組(P均<0.05)；黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組AST、CPK、LDH和MDA含量均明顯低于H2O2組(P<0.05)；黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組CPK、MDA含量均顯著低于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P均<0.05)，而2組間AST、CPK、LDH含量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

圖8　黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量(流式細胞儀)

圖9　黃芪多糖 40 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量(流式細胞儀)

圖10　黃芪多糖 80 μmol/L+H2O2組心肌細胞ROS含量(流式細胞儀)表2　各組心肌細胞培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量比較

組別nAST/(IU/mL)CPK/(IU/mL)LDH/(IU/L)MDA/(nmol/L)空白對照組1022.4±5.01.4±0.4518.5±73.80.21±0.04H2O2組1036.1±7.6①2.8±0.6①946.2±136.4①0.49±0.07①黃芪多糖20μmol/L+H2O2組1033.5±8.22.4±0.7871.6±142.80.42±0.09黃芪多糖40μmol/L+H2O2組1028.0±5.7②2.0±0.6②③748.3±115.0②0.31±0.06②③黃芪多糖80μmol/L+H2O2組1024.1±5.2②1.7±0.4②672.5±88.7②0.23±0.05②

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與H2O2組比較，P<0.05；③與黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組比較，P<0.05。

2.5各組心肌細胞凋亡情況空白對照組細胞凋亡率為(4.5±1.7)%，H2O2組為(57.9±8.2)%，黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組為(48.6±7.4)%，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組為(35.0±5.8)%，黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組為(17.1±5.2)%。H2O2組細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)；黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞凋亡率均顯著低于H2O2組(P均<0.05)；黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞凋亡率明顯低于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P<0.05)。各組心肌細胞凋亡情況見圖11～15。

圖11　空白對照組心肌細胞凋亡情況

圖12　H2O2組心肌細胞凋亡情況

圖13　黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組心肌細胞凋亡情況

圖14　黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組心肌細胞凋亡情況

圖15　黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組心肌細胞凋亡情況

2.6各組心肌細胞中NF-κB蛋白表達情況空白對照組心肌細胞中NF-κB蛋白表達量為0.17±0.04，H2O2組為0.51±0.09，黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組為0.42±0.10，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組為0.36±0.07，黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組為0.24±0.06。H2O2組心肌細胞中NF-κB蛋白表達量明顯高于空白對照組(P<0.05)，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組心肌細胞中NF-κB蛋白表達量均顯著低于H2O2組(P均<0.05)；黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組心肌細胞中NF-κB蛋白表達量顯著低于黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組(P<0.05)。見圖16。

A為空白對照組；B為H2O2組；C為黃芪多糖20 μmol/L+H2O2組；D為黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組；E為黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組圖16　各組心肌細胞中NF-kB蛋白表達情況(Western blot)

3討論

隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，冠心病及其所引發的急性心肌梗死發病率逐年上升，已經發展成為危害人類生命健康的主要疾病之一。目前臨床上主要采取溶栓、介入支架等手段恢復血流供應，從而挽救患者生命，但再灌注損傷嚴重影響患者愈后。近年來研究表明缺血再灌注后隨著氧的大量涌入，ROS大量生成和過剩而誘發的廣泛氧化應激損傷是再灌注損傷關鍵病理基礎[1]。

細胞中ROS過剩是機體發生氧化應激損傷的病理基礎，所以ROS含量檢測成為反映機體氧自由基損傷最直接的指標[7]。正常生理狀態下，體內生成的ROS能夠在SOD的催化作用下還原生成H2O2，并在GSH-Px或CAT催化作用下進一步還原生成對人無害的H2O和O2[8-9]，因此SOD、GSH-Px、CAT共同構成了機體的抗氧化防御系統，它們的活性直接反映機體抗氧化能力；此外，血清中脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映細胞損傷程度。正常生理狀態下，血清中心肌酶含量非常低，而當細胞膜受氧自由基攻擊而受損后將導致細胞中AST、CPK、LDH迅速釋放入血，導致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能夠敏感地反映心肌細胞受損程度。

氧化應激損傷是細胞凋亡非常重要的誘發因素之一，而NF-κB為多效能核轉錄因子，被稱為連接氧化應激損傷和細胞凋亡的“橋梁”[10-11]。生理狀態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中，而當細胞受到ROS攻擊時，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號而進入胞核內；Zhang 等[12]研究發現，活化NF-κB能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導促凋亡信號釋放而導致細胞凋亡；Li 等[13]研究發現，被活化的NF-κB進入細胞核后能夠與DNA的相應位點結合，參與調控下游相關靶基因的轉錄表達，包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，而iNOS可誘導NO生成繼而引發細胞凋亡，證實NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。

本實驗結果發現，與H2O2組比較，黃芪多糖40 μmol/L+H2O2組和黃芪多糖80 μmol/L+H2O2組細胞存活率及細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高，ROS含量顯著降低，培養液中AST、CPK、LDH和MDA含量及細胞凋亡率、NF-κB蛋白表達量均顯著降低。提示黃芪多糖可以能通過提高心肌細胞存活率、改善抗氧化酶活性、提高ROS清除能力、降低心肌酶含量、抑制細胞凋亡、下調NF-κB蛋白表達，從而對H2O2誘導乳鼠心肌細胞氧化應激損傷起保護作用，且高劑量效果更好。

[參考文獻]

[1]Lamendola P,Di Monaco A,Barone L,et al. Mechanisms of myocardial cell protection from ischemia reperfusion injury and potential clinical implications[J]. Ital Cordial (Rome),2009,10(1):28-36

[2]Chen HL,Li DF,Chang BY,et al. Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers[J]. Poult Sci,2003,82(3):364-370

[3]李紅法,郭松波,滿淑麗,等. 乙醇分級沉淀提取黃芪多糖及其理化性質和抗氧化活性研究[J]. 中國中藥雜志,2015,40(11):2112-2116

[4]于勝男,曹瓊丹,魯美麗,等. 黃芪多糖對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2015,31(4):102-105

[5]巢蕾,周杰,朱萱萱,等. 黃芪多糖對人胃癌細胞系MKN45的生長抑制作用及細胞周期的影響[J]. 中華中醫藥學刊,2012,30(11):2474-2477

[6]李澎,王建農,盧樹杰,等. 山楂葉原花青素對乳鼠心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 中國中藥雜志,2009,34(1):96-99

[7]Misra MK,Sarwat M,Bhakuni P,et al. Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes[J]. Med Sci Monit,2009,15(10):209-219

[8]Lartigue A,Burlat B,Coutard B,et al. The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase: the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J]. J Virol,2014,2588(14):254-261

[9]Jin Y,Liu K,Peng J,et al. Rhizoma dioscoreae nipponicae polysaccharides protect HUVECs from H2O2-induced injury by regulating PPARγ factor and the NADPH oxidase/ROS-NF-κB signal pathway[J]. Toxicol Lett,2014,232(1):149-158

[10] 陳良金,石孟瓊,賀海波,等. 珠子參總皂苷對H2O2誘導新生大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用[J]. 中國臨床藥理學與治療學,2012,17(8):860-867

[11] 楊帆,王永青,彭余江,等. NF-κB在顱腦損傷后繼發氧化應激及細胞凋亡之間的關系研究[J]. 浙江創傷外科,2014,19(6):899-902

[12] Zhang Q,Huang WD,Lv XY,et al. Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling[J]. Eur J Pharmacol,2011,654(2):142-149

[13] Li Q,Xu LS. Mechanism of destruction of islet cells by exogenous nitric oxide[J]. Med J Natl Def Force Northwest China,2002,23(5):361-363

Effects of Astraglus Polysaccharides on oxidative stress injury in neonatal rat cadiocytes induced by H2O2

SHEN Yujue

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Astraglus Polysaccharides (APS) on oxidative stress injury of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2. Methods Cadiocytes of neonate rat was separated and cultivated for 72 hours and then were divided into six groups: normal control group, H2O2 group, 20 μmol/L APS+H2O2 group, 40 μmol/L APS+H2O2 group, 80 μmol/L APS+H2O2 group, each group had 10 multiple pores. After intervention for twelve hours with respective drugs, the survival rate was detected by MTT; the activity of SOD, CAT, GSH-Px in cardiomyocytes were determined by ultraviolet-visible spectrophotometer; and the content of ROS was detected by fluorescence probe technique, the content of AST, CPK, LDH and the content of MDA in culture medium were detected by automatic biochemistry analyzer; the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated; the expression of NF-κB proten was detected by Western blot and Semi-quantitative analysized. Results Compared with H2O2 group, the survival rate in APS(40, 80 μmol/L)+ H2O2 groups were significantly increased; the activity of SOD, CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of ROS were significantly decreased; the content of AST, CPK, LDH and MDA in culture medium were significantly decreased; the cardiomyocytes apoptosis were improved and the apoptosis rate were significantly decreased, the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated, all of the difference were significant(P<0.05, P<0.01). Conclusion APS had inhibitive effects on oxidative stress of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2, which perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase, enhancing the free radical scavenging ability, down-regulating the expression of NF-κB protein, depressing apoptosis.

Key words:Astraglus Polysaccharides; H2O2; cardiomyocytes; oxidative stress

[作者簡介]沈玉玨，女，碩士，主治醫師，主要從事心內科疾病研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.010

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)19-2083-06

[收稿日期]2015-12-10