新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細胞線粒體自噬的機制研究

陸　瑩，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230061)

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新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細胞線粒體自噬的機制研究

陸瑩，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230061)

[摘要]目的探討新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細胞線粒體自噬的機制。方法MTT試驗檢測新藤黃酸對黑色素瘤B16細胞增殖的抑制作用;倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細胞在新藤黃酸作用下產(chǎn)生的形態(tài)變化；透射電鏡觀察新藤黃酸對黑色素瘤B16細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響；流式細胞術(shù)檢測新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位及ROS的改變；Western blot 法檢測LC-3、mTOR、AMPK及SIRT3等自噬相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示新藤黃酸在體外對黑色素瘤B16細胞的生長及增殖有明顯抑制作用，且隨著新藤黃酸濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力明顯下降；倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細胞顯示隨著新藤黃酸濃度增加，細胞結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細胞死亡增多；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞后，細胞發(fā)生明顯的線粒體自噬的形態(tài)學(xué)變化；Western blot法檢測表明隨著新藤黃酸給藥時間的延長， AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表達量呈時間依賴性上升，LC3-I蛋白表達量呈時間依賴性下降，mTOR蛋白表達量隨著時間延長有所下降。結(jié)論新藤黃酸在一定時間和濃度范圍內(nèi)能夠抑制黑色素瘤B16細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞發(fā)生線粒體自噬，其誘導(dǎo)細胞線粒體自噬的機制可能與調(diào)控ROS/SIRT3/AMPK信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]新藤黃酸;黑色素瘤；B16細胞；線粒體自噬;分子機制

皮膚黑色素瘤是一種源于黑色素細胞且惡性程度極高的腫瘤，屬于皮膚癌的一種，因其具有易轉(zhuǎn)移，對傳統(tǒng)放、化療均不敏感等特性及近年發(fā)病率呈逐年增高和相對年輕化趨勢，使其成為現(xiàn)階段國內(nèi)外皮膚腫瘤研究的熱點[1-2]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)對黑色素瘤治療效果良好的藥物。藤黃是藤黃科植物藤黃樹所分泌出來的干燥樹脂，古醫(yī)書中記載其具有解毒、抗炎和驅(qū)蟲等生物學(xué)功能[3]，在現(xiàn)代中醫(yī)臨床中被廣泛應(yīng)用于治療癌癥、瘡瘍、毛囊炎等[4]。呂歸寶等[5]于1984年分離得到一種分子結(jié)構(gòu)與藤黃酸相類似的化合物，命名為新藤黃酸。本實驗室前期的研究結(jié)果初步表明，新藤黃酸能夠選擇性抑制多種腫瘤細胞的生長，且與藤黃酸相比，其毒性較低，而抗腫瘤活性更加廣泛。然而，目前人們對新藤黃酸的抗腫瘤作用機制還不十分清楚。本研究觀察了新藤黃酸在體外抗黑色素瘤B16細胞的作用，并對其抗癌機制進行了初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1藥物及實驗試劑新藤黃酸(粉針，純度≥99%，亮黃色結(jié)晶體)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)王效山教授提供。新藤黃酸加入適量DMSO中，使其充分溶解，再用 RPMI-1640培養(yǎng)液將其稀釋成100 mmol/L的母液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存時間不超過2周。RPMI-1640(Gibco公司)，胎牛血清(Thermo Fisher scientific公司)，胰蛋白酶(Amersco公司)，MTT(Amersco進口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司)，JC-1(Bestbio公司)，PBS(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，BSA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，Western及IP細胞裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，PMSF(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2細胞株黑色素瘤B16細胞來源于本實驗室。細胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3主要儀器超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，Spectra Max M5多功能酶標儀(美國MD公司)，Hi-tachi-600透射電子顯微鏡(日本日立)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(Flow Cytometry，美國Becton Dickinson公司)。

1.4方法

1.4.1MTT試驗取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細胞消化收集，將細胞密度調(diào)整為6×104mL-1并接種于無菌的96孔板中，每孔加100 μL細胞懸液，實驗設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組。接種后培養(yǎng)過夜，在倒置顯微鏡下確認細胞貼壁良好，實驗組加入不同濃度的新藤黃酸溶液(0，0.75，1.5，3.0，6.0 μmol/L)，細胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48，72 h。于結(jié)束培養(yǎng)前4 h小心吸去細胞培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔再加入DMSO 150 μL，振蕩10 min混勻。570 nm波長下用Spectra Max M5多功能酶標儀檢測每孔光密度值(OD值)，實驗重復(fù)3次，并按照下列公式計算：細胞增殖抑制率(%)=(陰性對照OD值-實驗組OD值)/陰性對照OD值×100%。改良寇式法：lgIC50=Xm-I×[P-(3-Pm-Pn )/4][Xm為lg(最大劑量)；I為lg(最大劑量/相鄰劑量)；P為陽性反應(yīng)率之和；Pm為最大陽性反應(yīng)率；Pn為最小陽性反應(yīng)率]。

1.4.2倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細胞形態(tài)變化取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細胞消化收集，調(diào)整為4×104mL-1濃度的細胞懸液接種于無菌6孔板中，每孔加入2 mL。接種后培養(yǎng)過夜，確認貼壁良好后按實驗分組加入不同濃度的新藤黃酸溶液(0，1.5，3.0 μmol/L)，處理24 h后置于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)并拍照。

1.4.3透射電鏡觀察黑色素瘤B16細胞線粒體自噬情況取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細胞消化收集，接種于無菌6孔板，培養(yǎng)過夜后分別加入1.5，3.0 μmol/L新藤黃酸溶液處理24 h，空白對照組加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。胰酶消化后離心收集細胞，用預(yù)冷的PBS將細胞洗2遍，4 ℃環(huán)境下用2.5%戊二醛將細胞團塊固定12 h以上，制備超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察并攝片。

1.4.4流式細胞術(shù)檢測黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位消化收集分別用0，1.5，3.0，6.0 μmol/L新藤黃酸溶液處理24 h的黑色素瘤B16細胞，加入終濃度為5 μg/L的JC-1染液，于37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育10 min，800 r/min低速離心5 min，棄去上清液，用RMPI-1640培養(yǎng)基清洗細胞2次，將細胞重懸于培養(yǎng)基中，再于37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，上流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488～505 nm，發(fā)射波長515～575 nm)。

1.4.5Western blot檢測黑色素瘤B16細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白變化將黑色素瘤B16細胞用3.0 μmol/L新藤黃酸溶液分別處理0,6,12,24 h后提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。10%～15%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉封閉，4 ℃一抗孵育過夜。PBST洗滌3次，每次10 min。再加HRP標記的二抗稀釋液室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min。ECL試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

2結(jié)果

2.1黑色素瘤B16細胞增殖抑制率黑色素瘤B16細胞增殖抑制率隨新藤黃酸濃度的增加及作用時間的延長而升高(P<0.05)。見圖1。

圖1　不同濃度新藤黃酸作用不同時間黑色素瘤B16細胞增殖抑制率

2.2黑色素瘤B16細胞形態(tài)變化倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未加新藤黃酸處理的黑色素瘤B16細胞數(shù)目較多,細胞伸展良好,胞質(zhì)均勻透明；1.5 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)部分細胞固縮變圓，體積變小，少量細胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態(tài)；3.0 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞24 h后可觀察到多數(shù)細胞固縮變圓，脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，少數(shù)細胞體積增大、腫脹、破裂呈壞死狀。見圖2～4。

圖2　未經(jīng)新藤黃酸處理黑色素瘤B16細胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

圖3　1.5 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

圖4　3.0 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

2.3黑色素瘤B16細胞線粒體自噬情況透射電鏡下可見未經(jīng)新藤黃酸處理的黑色素瘤B16細胞形態(tài)未發(fā)生改變，細胞核染色質(zhì)分布均勻，細胞線粒體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰,基本沒有自噬線粒體形成；1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后的黑色素瘤B16細胞內(nèi)可見少量線粒體出現(xiàn)腫脹及空泡結(jié)構(gòu)，未見脊斷裂，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常，只出現(xiàn)少量自噬線粒體；3 μmol/L新藤黃酸處理24 h后的黑色素瘤B16細胞可見核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)大量自噬線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂且多空泡化，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡聚集，部分空泡內(nèi)可見內(nèi)容物，并有部分線粒體被包裹進囊泡。見圖5～7。

2.4黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，不同濃度的新藤黃酸溶液作用黑色素瘤B16細胞24 h后，線粒體膜電位水平隨新藤黃酸濃度的增加而逐漸下降，其中6 μmol/L新藤黃酸作用24 h后，線粒體膜電位下降非常明顯。見圖8～11。

2.5黑色素瘤B16細胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達情況3 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細胞后，隨著作用時間的延長，AMPK、SIRT3 及LC3-II蛋白表達量呈時間依賴性上升，LC3-I蛋白表達量呈時間依賴性下降，mTOR蛋白表達量隨著時間延長有所下降。見圖12。

圖5　未經(jīng)新藤黃酸處理24 h后細胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖6　1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后細胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖7　3.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后細胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖8　未經(jīng)新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位

圖9　1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位

圖10　3.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位

圖11　6.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細胞線粒體膜電位

圖12　黑色素瘤B16細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達情況

3討論

據(jù)統(tǒng)計，目前惡性腫瘤已成為人類死亡原因的第一位，而黑色素瘤作為一種惡性皮膚瘤，因其易轉(zhuǎn)移及對放化療不敏感等特性，已成為當前研究熱點之一。細胞線粒體自噬是發(fā)生在細胞內(nèi)的一種選擇性的自噬過程，最早由Lematsters于2005年提出，主要指在活性氧(ROS)、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老等刺激下，細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，而損傷的線粒體又被特異性地包裹進自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成線粒體損傷的降解，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

SIRT3是NAD+依賴的第Ⅲ類組蛋白去乙?；傅某蓡T,這個家族簡稱sirtuins(SIRTS)，在整個SIRTS家族中,SIRT3作為線粒體去乙酰酶,對抗衰老和癌癥發(fā)生的作用較明顯,但是其作用機制還尚不明確,可能與線粒體內(nèi)ROS水平相關(guān)，SIRT3可上調(diào)AMPK磷酸化水平，而 SIRT3H248Y對其磷酸化無影響，說明SIRT3激活A(yù)MPK磷酸化依賴于其去

乙?；饔肹6]。目前，AMPK在癌癥中的作用已經(jīng)受到眾多研究者的廣泛關(guān)注，其在正常組織中具有抑制腫瘤細胞形成的作用，而在體外，AMPK也被證明對多數(shù)人類腫瘤細胞株如肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌[7-9]具有毒性作用。同時研究發(fā)現(xiàn)在SIRT3缺失的小鼠生殖細胞系中，線粒體ROS的水平有所上調(diào)，而在SIRT3表達的細胞中ROS水平被抑制[10]。以上均表明SIRT3在線粒體中發(fā)揮作用，其缺失能夠引起異常的線粒體代謝和細胞損傷，與惡性腫瘤的發(fā)生具有某種潛在聯(lián)系。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸在體外對黑色素瘤B16細胞的生長及增殖有明顯抑制作用，且隨著新藤黃酸濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力明顯下降；隨著新藤黃酸濃度增加，細胞結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細胞死亡增多，細胞發(fā)生明顯線粒體自噬的形態(tài)學(xué)變化；隨著新藤黃酸給藥時間的延長，AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表達量呈時間依賴性上升，LC3-Ⅰ蛋白表達量呈時間依賴性下降，mTOR蛋白表達量隨著時間延長有所下降。提示新藤黃酸能夠在一定時間和濃度范圍內(nèi)抑制黑色素瘤B16細胞中ROS/SIRT3/AMPK這一信號傳導(dǎo)通路的過度活化，誘導(dǎo)黑色素瘤B16細胞發(fā)生線粒體自噬。

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Study on the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid

LU Ying, LI Qinglin

(Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230061, Anhui, China)

Abstract:Objective It is to explore the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid. Methods MTT experiment was used to detect the inhibition of Gambogenic acid on proliferation of melanoma B16 cell. The morphology changes of the cells were observed under inverted microscope. The effect of Gambogenic acid on the mitochondrial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. Membrane potential and ROS changes in mitochondria were detected by flow cytometry.The correlated protein of mitochondrial autophagy such as LC-3, mTOR, AMPK and SIRT3 were detected by Western blot method. Results MTT results showed that Gambogenic acid has inhibition on the growth and proliferation of B16 cells, with the increase of concentration and time, the activity of the cells get lower and lower. The results under inverted microscope showed that with the concentration increase, the cell structure was damaged more obviously with more death cells. The results under transmission electron microscopy showed than the obvious morphology changes of B16 cells like mitochondrial autophagy could be found after induce by Gambogenic acid. Western blot method results showed that the expression of AMPK, SIRT3 and LC3-Ⅱ had a time dependence increase and LC3-Ⅰ had a time dependence decrease, that of mTOR decreased a little with time increase. Conclusion Gambogenic acid can inhibit the proliferation of B16 cell in some range of time and dosage, it can induce the mitochondrial autophagy, and the mechanism may be related with its regulation of ROS/SIRT3/AMPK signal pathway.

Key words:Gambogenic acid; melanoma B16 cell; mitochondrial autophagy; molecular mechanism

[作者簡介]陸瑩，女，在讀碩士研究生，研究方向為分子藥理學(xué)。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.009

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)19-2079-04

[收稿日期]2016-01-28