艾粉β-環糊精包合物的質量標準研究Δ

陳振夏，謝小麗，龐玉新，王　凱，楊　全，鄒　婧

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 儋州　571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心，海南 儋州　571737； 3.廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州　510006)

?

·論著·

艾粉β-環糊精包合物的質量標準研究Δ

陳振夏1,2*，謝小麗1,2,3，龐玉新1,2#，王凱1,2，楊全3，鄒婧1,2,3

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 儋州571737； 2.海南省艾納香工程技術研究中心，海南 儋州571737； 3.廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州510006)

摘要目的：對艾粉β-環糊精包合物的質量標準進行研究。方法：通過薄層色譜法、顯微成像法和氣相色譜法對包合物進行鑒別以及定性、定量分析。結果：顯微成像法驗證了包合物的形成；薄層色譜法鑒別可以檢測出包合物中左旋龍腦對應的斑點，斑點清晰，空白對照組無干擾；采用氣相色譜法對包合物中的左旋龍腦進行含量測定，6份艾粉β-環糊精包合物中左旋龍腦的載藥量為15.11%～17.52%，平均載藥量為16.18%，加樣平均回收率為98% (RSD=0.67%)。結論： 該研究方法操作簡便，準確性高，可作為該包合物的質量控制參考標準。

關鍵詞艾粉； 包合物； 質量標準

艾粉是菊科植物艾納香(BlumeabalsamiferaL. DC.)的葉和枝條經水蒸氣蒸餾而得到的一種粉狀粗加工品[1-2]。其味辛涼、苦，微寒，主要成分為左旋龍腦，其含量能達到88.4%[3]，此外還含有異龍腦、芳樟醇、石竹烯、α-石竹烯等萜類化合物，具有抑菌、抗炎、抗氧化、鎮痛、驅蟲、祛風等多種生理活性[4]。但由于艾粉易揮發，難溶于水，不利于后期制劑的制備。因此，本實驗采用了包合技術制備了艾粉β-環糊精(beta-Cyclodextrin,β-CD)包合物，通過顯微成像法、薄層色譜法對包合物進行鑒別驗證，同時建立了包合物中左旋龍腦含量分析方法，為含有艾粉的制劑提供簡便可靠的質控方法。

7890A型氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司，包括FID檢測器，G4513A 16位自動進樣器)；DHG-9035A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；CPA225D型分析天平(Srtarius公司)；Heraeus Multifuge X3R型高速冷凍離心機(ThermoFisher公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Axio Imager M2型正置顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2藥品與試劑

β-CD(江蘇豐園生物技術有限公司，分子量1 134.98，含量≥98%)；艾粉(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，左旋龍腦含量≥60%)；左旋龍腦對照品(阿法埃莎化學有限公司，純度>98%，批號10147015)，水楊酸甲酯(天津光復精細化工研究所，純度>99.5%)，其余試劑均為國產分析純。

在室溫下，稱取適量β-CD置于研磨缽中，加入4倍量的蒸餾水沿同一方向研勻，使溶液呈糊狀，研磨3 min后，再按β-CD與艾粉4∶1(質量)的比例邊研磨邊加入艾粉乙醇溶液，研磨45 min后，置4 ℃冰箱冷藏12 h后取出，抽濾，再用乙酸乙酯清洗3次，每次超聲15 min后離心10 min(轉速為3 000 r/min)，以除去未被包合的艾粉，45 ℃烘箱干燥，即得[5-8]，按以下公式計算包合物收得率與載藥量：

(1)收得率(%)=包合物質量(g)/[β-環糊精加入量(g)+艾粉加入量(g)]×100%；

(2)載藥量(%)=包合物中左旋龍腦含量(g)/包合物重量(g)×100%。

2.2外觀

本品為類白色疏松狀粉末，顏色均勻。

2.3粒度測定

依據《中國藥典》2010年版第二部，采用雙篩分法，取艾粉環糊精包合物30 g，稱定其質量，置藥篩中，保持水平狀態過篩，左右往返，邊篩動邊輕叩3 min，取能通過6號篩(篩孔直徑 0.15 mm)與不能通過4號篩(篩孔直徑0.25 mm)的包合物，稱其重量，計算其所占百分比小于10%[9]。

2.4定性鑒別

2.4.1薄層色譜法[10]：精密稱取艾粉β-CD包合物適量，加乙醇，超聲處理15 min，破壞艾粉β-CD包合物，靜置過夜，次日離心，取上清夜作為艾粉β-CD包合物溶液備用；同法制備空白β-CD陰性樣品溶液，再精密稱取左旋龍腦對照品與艾粉適量，加無水乙醇制備左旋龍腦對照品溶液與艾粉對照溶液。取左旋龍腦對照品溶液、艾粉對照溶液、艾粉β-CD包合物溶液與空白β-CD陰性樣品溶液，分別點樣于同一塊硅膠G板上，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=4 ∶1)展開，取出，晾干，用10%的硫酸乙醇溶液顯色，加熱至斑點顯色清晰。結果顯示，左旋龍腦對照品溶液、艾粉對照溶液、艾粉β-CD包合物溶液在相應位置處顯相同顏色的斑點，而空白β-CD陰性樣品溶液在相位置處未顯斑點，見圖1。

1.左旋龍腦對照品溶液；2.艾粉對照溶液；3.艾粉β-CD包合物溶液；4.空白β-CD陰性樣品溶液1. L-borneol control solution; 2. Aifen reference solution;3. Aifen of β-CD inclusion complex solution; 4. Blank β-CD negative sample solution圖1　艾粉β-CD包合物的薄層色譜Fig 1　TLC of aifen of β-CD inclusion

2.4.2顯微驗證[11]：分別取適量艾粉、β-CD和艾粉β-CD包合物于研缽中研細后，置于載玻片上，待觀察。另按1∶4比例分取艾粉、β-CD少許混合后再置于研缽中研細，作為物理混合物。將載有樣品的載玻片置于光學顯微鏡下(10×40倍)觀察，顯微結果顯示，艾粉表面呈星點透亮狀的不規則晶體狀物質，β-CD中間是透亮的不規則團狀物質，物理混合物是2種不同大小的團狀物質黏附在一起，而包合物是不透明的團狀物質，內含黑色物質，表觀形態發生變化，表明包合物的形成，見圖2。

A.艾粉顯微照片； B.β-CD顯微照片；C.艾粉與β-CD物理混合物顯微照片； D.艾粉β-CD包合物顯微照片A.Microscopic image of aifen; B.Microscopic image of β-CD; C.Microscopic image of physical mixture of aifen and β-CD;D.Microscopic image of β-CD inclusion complex圖2　艾粉β-CD包合物的顯微成像圖Fig 2　Microscopic image of aifen of β-CD inclusion complex

2.5含量測定

2.5.1色譜條件：HP-5石英毛細管色譜柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以80 ℃為起始溫度，保持2 min，先以5 ℃/min 升溫至 100 ℃，然后以20 ℃/min升溫至200 ℃，進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度240 ℃；氮氣流速：25 ml/min；氫氣流速：30 ml/min；空氣流速：400 ml/min；進樣量為0.6 μl，分流比為9 ∶1。

2.5.2內標溶液的制備：精密稱取適量水楊酸甲酯，以無水乙醇溶解并定容，搖勻，得質量濃度為1.343 3 mg/ml的溶液，作為內標儲備液。

2.5.3對照品溶液的制備：精密稱取左旋龍腦對照品適量，以無水乙醇定容，搖勻，得質量濃度為2 mg/ml的溶液，作為左旋龍腦對照品儲備液。精密量取1 ml對照品儲備液于10 ml容量瓶，加入內標溶液1 ml，加無水乙醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.5.4供試品溶液的制備：精密稱取50 mg包合物樣品置50 ml離心管中，加入20 ml無水乙醇，超聲破壞15 min后靜置過夜，次日離心10 min(3 000 r/min)。精密量取3 ml上清液于10 ml容量瓶，加入內標溶液1 ml，加無水乙醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

A．陰性對照溶液；B.內標溶液；C.對照品溶液；D.供試品溶液；1.左旋龍腦色譜峰；2.內標溶液色譜峰 A.Negative control solution; B.Internal standard solution; C.Control solution; D.Test solution; 1.Chromatographic peak of L-borneol; 2.Chromatographic peak of internal standard solution圖3　艾粉β-CD包合物氣相色譜圖Fig 3　GC of aifen of β-CD inclusion complex

2.5.5陰性對照品溶液：精密稱取適量的空白β-CD樣品，按“2.5.4”項下方法進行處理，即得。

2.5.6系統適應性：在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液、內標溶液各0.6 μl進樣分析，記錄色譜圖(見圖3)，供試品色譜圖在與對照品色譜相應保留時間處有相同的色譜峰，而陰性對照溶液色譜圖在與對照色譜圖相應保留時間無色譜峰，表明β-CD對樣品的測定無干擾。

2.5.7線性試驗：分別精密吸取對照品儲備液0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 ml置于10 ml容量瓶中，各加入1 ml內標溶液，再以無水乙醇稀釋至刻度搖勻。分別取上述6種濃度溶液，進樣0.6 μl分析，以左旋龍腦峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，以相應濃度的比值為橫坐標，得線性回歸方程為Y=18.281X-0.149 4(r=0.999 8)。結果表明，左旋龍腦在0.02～1.00 mg/ml質量濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5.8精密度試驗：精密量取“2.5.3”項下對照品儲備液1 ml，置于10 ml容量瓶中，加入內標液1 ml，加無水乙醇定容，搖勻，在上述色譜條件下，連續進樣6次，記錄左旋龍腦與內標液色譜峰的相對峰面積，并計算RSD為0.66%。

2.5.9穩定性試驗：取同一份樣品，按“2.5.4”項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、2、4、8、10、12 h按上述色譜條件進樣測定，記錄左旋龍腦色譜峰與內標色譜峰的相對峰面積，計算其RSD為1.35%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.5.10重復性試驗：精密稱取同一批樣品6份，按“2.5.4”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄左旋龍腦色譜峰與內標色譜峰的相對峰面積，測定左旋龍腦的含量均值為16.79 mg，RSD為0.43%

2.5.11左旋龍腦檢出限與定量限：精密量取左旋龍腦對照品溶液0.6 μl，在上述色譜條件下，進樣分析，測得信噪比約為3 ∶1時，最低檢測限為0.139 μg；信噪比約為10 ∶1時，定量限為0.407 μg。

2.5.12加樣回收率試驗：精密稱取6份已知左旋龍腦含量的包合物樣品，按“2.5.4”項下方法破壞包合物，精密量取3 ml上清液于10 ml容量瓶中，分別精密加入左旋龍腦對照品溶液及1 ml內標溶液，再加入無水乙醇定容，得供試溶液，在本色譜條件下，進樣分析，測定左旋龍腦含量，計算回收率，平均回收率為98%，RSD為0.67%，見表1。

表1　左旋龍腦加樣回收率試驗

2.5.13樣品中左旋龍腦的含量測定：分別精密稱取6個不同批次的包合物，按“2.5.4”項下方法操作，制備供試品溶液，進樣分析，6批包合物樣品中含量為15.11%～17.52%，平均含量為16.18%，見表2。

表2　包合物含量測定結果

3討論

據文獻報道，艾粉的抗炎鎮痛、抑菌止癢等生理活性與其含有大量的揮發性物質有關，而其中左旋龍腦為主要成分，其含量甚至能達到88.40%[3]，故選擇左旋龍腦為含量測定的指標成分。另外，氣相色譜法能直接測定某單一組分的含量，而且具有方法準確、精密度高、樣品用量少等特點，是艾粉β-CD包合物中左旋龍腦含量測定的可行方法。

顯微成像法與薄層色譜法是環糊精包合物常用的驗證方法[12]。在顯微鏡下含藥的包合物由于晶格的排列發生變化造成形狀不同，根據對比分析包合物的相態變化及晶格變化可判斷包合物是否形成。而通過薄層色譜法可以看到，在同樣的條件下，空白的環糊精不會有展開斑點，而包合物與原料藥以及對照品在同一位置有對應的斑點，也說明了包合物未影響艾粉的化學性質。

參考文獻

[1]江興龍,番俊鋒,司健，等.貴州艾納香產地采收提取艾粉技術研究[J].生物質化學工程,2006,40(1):17-20.

[2]王中洋,龐玉新,楊全，等.中藥冰片資源及生產加工現狀[J].中國現代中藥,2014,16(9):780-784.

[3]吳麗芬,楊全,龐玉新,等.GC同時測定艾粉中樟腦、異龍腦、L-龍腦、β-石竹烯和花椒油素的含量及其聚類分析[J].中國藥學雜志,2015,50(9):10-14.

[4]王遠輝.艾納香葉中左旋龍腦與精油的制備及其抗氧化與抗菌活性研究[D].無錫:江南大學,2013.

[5]宋鳳蘭,金海杰,潘育方，等.白紙扇感冒顆粒中揮發油β-環糊精包合物的制備[J].中國實驗方劑學,2012,18(23):9-12.

[6]鄭曉霞,張丹參,黃紅娜，等.大黃酚-羥丙基-β-環糊精包合物的工藝優選及鑒定[J].中成藥,2010,32(9):1518-1521.

[7]王靜,邢煜軍,張保國，等.甘松揮發油β-環糊精包合工藝研究[J].中成藥,2011,33(9):1607-1610.

[8]郭麗蓉,周莉玲.冰片β-環糊精包結物制備方法的比較研究[J].時珍國醫國藥,2011,22(6):1462-1464.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社,2010:附錄73.

[10]鄧紅,李欣蔚,林華慶,等.薄荷、白術混合揮發油β-環糊精包合物的制備和鑒別[J].廣東藥學院學報,2011,27(4):341-344.

[11]金鄰豫,蔡源源,王博，等.銀杏葉提取物包合物的制備及其顯微驗證[J].河南大學學報：醫學版,2007,26(4):26-28.

[12]常美玲,薛彥朝,粘立軍，等.β-環糊精包合物質量檢測研究進展[J].中國中醫藥,2012,10(16):164-165.

Quality Standard on Aifen ofβ-CD Inclusion ComplexΔ

CHEN Zhenxia1,2, XIE Xiaoli1,2,3, PANG Yuxin1,2, WANG Kai1,2, YANG Quan3, ZOU Jing1,2,3

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Labor-atory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Hainan Danzhou 571737, China; 2.Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera, Hainan Danzhou 571737, China; 3.School of Traditional Chinese, Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To research quality standard on aifen of β-CD inclusion complex. METHODS: To identify and qualitative and quantitative analyze the inclusion complex by TLC, microscopic imaging and GC. RESULTS: Microscopic imaging can verify the formation of inclusion complex, and the analysis of TLC showed the sample and contrast had the same color spots with similar RF value. GC to measure the content of L-borneol, The L-borneol content of 6 inclusion complex were 15.11%-17.52%. The average content was 16.18%; and the average recovery rate was 98%(RSD=0.67%). CONCLUSIONS: The methods were simple, accurate, and can be used for quality control reference standard for the inclusion complex.

KEYWORDSAifen; Inclusion complex; Quality standard

1材料

1.1儀器

2方法與結果

2.1包合物制備

Δ基金項目：國家自然科學基金項目(No.81374065)；貴州省黔科合重大專項字(No.2013-6011) 湖北省衛生計生委員會計劃項目(No：2012Z-Y41)

#通信作者：研究員。研究方向：南藥資源研究與開發。E-mail: blumeachina@126.com 副主任藥師。研究方向：臨床藥學和藥理學。E-mail：1052543089@qq.com

中圖分類號R927.11

文獻標志碼A

文章編號1672-2124(2016)06-0728-04

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.06.002

(收稿日期：2016-01-05)

*研究實習員。研究方向：南藥研究與開發。E-mail:hnchenzhenxia@126.com

*主管藥師。研究方向：中藥藥理學。E-mail：jovea@126.com