刺芹側(cè)耳降解孔雀石綠的酶學(xué)研究

呂國(guó)英　張作法　程鴦祺（. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，浙江 杭州 300；. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 3004）

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刺芹側(cè)耳降解孔雀石綠的酶學(xué)研究

呂國(guó)英1張作法1程鴦祺2
（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

關(guān)鍵詞刺芹側(cè)耳；降解；酶；孔雀石綠

白腐真菌是目前研究最多、染料脫色過(guò)程中最有效的真菌資源。許多研究表明，真菌降解染料主要是由于其具有非特異性和非選擇性的胞外酶系。白腐真菌產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶系，主要由漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木素過(guò)氧化物組成［1，2］，為非底物專一性酶，分泌到細(xì)胞外對(duì)多種有機(jī)物和染料具有廣譜的氧化降解作用。

孔雀石綠（Malachite green，MG）及其代謝物無(wú)色孔雀石綠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易分解，故在環(huán)境和生物體中代謝緩慢，容易積累，已被科學(xué)界確認(rèn)具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用［3］。目前分離到的對(duì)孔雀石綠具有脫色作用的微生物有細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、微藻等［4～7］。利用大型真菌搖瓶發(fā)酵液來(lái)降解孔雀石綠的研究少見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上篩選到一株刺芹側(cè)耳M1，其對(duì)MG具有良好的降解效果。本研究考察了刺芹側(cè)耳M1降解孔雀石綠的一些相關(guān)酶的酶活變化情況，為闡明脫色機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試菌種刺芹側(cè)耳 M1（Pleurotus eryngii M1，本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到）4 ℃保存于 PDA斜面培養(yǎng)基；孔雀石綠（MG）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從活化的斜面培養(yǎng)基上取一定量的菌絲塊接種到100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，置于250 mL三角瓶，150 r/min，25 ℃下振蕩培養(yǎng)5天。

1.4酶液提取

胞外酶提取：培養(yǎng)后的菌液于10 000 rpm下離心10 min，取上清即為胞外酶液。

胞內(nèi)酶提取：培養(yǎng)后的菌液于10 000 rpm下離心10 min，沉淀用0.9%NaCl溶液細(xì)胞洗滌3次，懸浮于磷酸緩沖液（100 mM，pH 7.4）中，超聲波處理5 min，懸浮液離心（10 000 rpm，4℃，15 min），棄沉淀，上清液即為胞內(nèi)酶液。

1.5酶活測(cè)定

酪氨酸酶、漆酶、錳過(guò)氧化酶、木質(zhì)素過(guò)氧化酶和NADH-DCIP還原酶測(cè)定方法見文獻(xiàn)［8］，作少許改動(dòng)。蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1個(gè)酶活力單位是指在特定條件（25 ℃，其他為最適條件）下，在1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1 μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。

比活為每分鐘每毫克酶蛋白在 25 ℃下轉(zhuǎn)化的底物的微摩爾數(shù)。

1.6脫色率的測(cè)定

Ao，At分別表示初始時(shí)刻和t時(shí)刻染料在619 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1.7酶的初步分離純化

分別對(duì)胞內(nèi)酶液和胞外酶液進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)純化。以100 mL酶液為例，硫酸銨在25 ℃時(shí)的溶解度為75 g，邊攪拌邊緩慢加入無(wú)水硫酸銨，分別在酶液中的硫酸銨達(dá)到溶解度的20%、40%、60%、80%、100%時(shí)提取沉淀，即0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)溶于pH=7.0的磷酸緩沖液中，制成酶液，再測(cè)蛋白濃度、降解率等參數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1酶活比較

測(cè)定酶活的酶液分為脫色前和脫色后兩種，數(shù)據(jù)顯示，胞內(nèi)酶液中的各酶活在加入MG后都略有降低，而在胞外酶液中，這一現(xiàn)象并不明顯，其中酪氨酸酶和木質(zhì)素氧化酶有降低的趨勢(shì)，而漆酶和NADH-DCIP還原酶反而有所升高。文獻(xiàn)報(bào)道［8］，MG在脫色前后反應(yīng)體系中起作用的酶的酶活將發(fā)生新變化，雖然本研究中的這幾種酶的酶活都有變化，但是除了漆酶外，其他酶活變化都很小（表1），基本可以忽略。已有文獻(xiàn)報(bào)道，一種白腐菌 Trametes sp.中的漆酶可以脫色 MG溶液［9］，所以我們推測(cè)在本研究的降解MG過(guò)程中漆酶起主要作用。

表1　脫色前后胞內(nèi)外酶活的變化

2.2酶的初步分離

胞內(nèi)酶液的分離純化結(jié)果顯示，硫酸銨溶解度的20%～40%區(qū)間內(nèi)分離到的蛋白質(zhì)最多，其次是 40%～60%區(qū)間。在0～20%區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)較少。蛋白質(zhì)在分離純化過(guò)程中會(huì)有損失，蛋白質(zhì)的最后回收率為71.8%（表2）。

表2　胞內(nèi)酶液分級(jí)沉淀結(jié)果

胞外酶液的分離純化結(jié)果為：硫酸銨溶解度在80%～100%區(qū)間內(nèi)分離到的蛋白質(zhì)最多，其次是60%～80%區(qū)間，0～20%區(qū)間內(nèi)沒(méi)有分離到蛋白質(zhì)。胞外酶液中，蛋白質(zhì)損失較大，回收率只有38.8%（表3）。

表3　胞外酶液分級(jí)沉淀結(jié)果

用原酶液和各區(qū)間分離到的酶液去降解孔雀石綠染料，在MG濃度相等的情況下，得出每毫克蛋白能達(dá)到的降解率，定義為單位降解率。結(jié)果如圖1所示，胞內(nèi)酶液的0～20%組分的蛋白質(zhì)濃度雖然很低，但是其活性很高，每毫克蛋白分擔(dān)到的降解率是最高的。胞外酶液的20%～40%區(qū)間組分的單位降解率原高于其他組分，而0～20%區(qū)間組分檢測(cè)不到蛋白質(zhì)存在。

圖1　各組分酶液MG降解率

3　討 論

孔雀石綠是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，屬三苯甲烷類染料，過(guò)去常被作為驅(qū)蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產(chǎn)中使用。由于其毒副作用大，雖然早已禁用，但研究廢水中所含孔雀石綠染料的脫色降解，對(duì)于治理染料的污染仍具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)外酶液中相關(guān)酶活，可以看出漆酶活性比其他酶要高，漆酶比活是其他酶活的好幾十倍。相對(duì)于胞內(nèi)酶液，胞外酶液中的漆酶比活雖有所降低，但仍高于其他酶。胞外液中的酪氨酸酶、木質(zhì)素氧化酶和NADH-DCIP還原酶的比活都略高于胞內(nèi)，錳過(guò)氧化酶胞內(nèi)胞外比活都很低。可以推測(cè)在脫色過(guò)程中起主要作用的是漆酶。對(duì)胞內(nèi)外酶液的硫酸銨沉淀進(jìn)行初步分離后，進(jìn)行脫色測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在胞內(nèi)酶液中活性主要集中在硫酸銨 0～20%組分中，雖然此組分的蛋白含量最少；而在胞外酶液中除了硫酸銨 0～20%區(qū)間組分檢測(cè)活性外，其他組分均有較高的活性，其中在20%～40%的組分中活性為最大，這也間接證明了胞外酶活性高于胞內(nèi)酶活性。

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中圖分類號(hào)：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-0934（2016）01-048-03

基金項(xiàng)目：浙江省農(nóng)科院2014年創(chuàng)新提升工程項(xiàng)目；浙江省食用菌育種專項(xiàng)（2012C12911）

作者簡(jiǎn)介：呂國(guó)英，博士，副研究員，主要從事食藥用菌研究工作。E-mail：bdzlgy@sohu.com