真姬菇液體培養特性及胞外酶的活性研究

張文斌　李文德　王治江　王少秋（. 甘肅省張掖市經濟作物推廣站，甘肅 張掖 734000；. 河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

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真姬菇液體培養特性及胞外酶的活性研究

張文斌1李文德1王治江2*王少秋2
（1. 甘肅省張掖市經濟作物推廣站，甘肅 張掖 734000；2. 河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

摘 要通過液體發酵方式，測定不同碳源、氮源、礦質元素、初始pH對真姬菇菌絲生長的影響及胞外酶活性。結果表明：真姬菇液體培養最適的碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為蛋白胨，最佳礦質元素是硫酸銅，適宜于生長的初始pH為4～6。在整個發酵期內，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶的酶活性高峰交替出現。其中：愈創木酚酶、羧甲基纖維素酶活性在第2天為高峰，鄰苯二酚酶出現在第3天，淀粉酶在第4天達到高峰。

關鍵詞真姬菇；液體培養；特性；胞外酶活性

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇、海鮮菇，秋季群生于闊葉樹的朽木上，廣泛分布于日本、歐洲、北美、西伯利亞等地。形態美觀、肉質脆嫩，味道鮮美似螃蟹。在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之說［1］，隸屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，是北溫帶一種優良的食用菌。富含賴氨酸、精氨酸、葡聚糖，具有促進青少年智力發育、抗癌、抵抗HIV病毒、降血壓、降低膽固醇、提高人體免疫力等功效［2］。

利用傳統的工藝生產固體菌種，生產周期長、環節多，污染不易控制；利用液體培養生產液體菌種有生產周期短、菌齡一致、接種簡便、成本低的優點［3］。近年來真姬菇的相關研究報道側重栽培和生物學特性方面，營養生理研究較少。筆者測定了真姬菇生長發育過程中羧甲基纖維素酶、淀粉酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶的活性變化，以期從中找出真姬菇在生長發育過程中胞外酶的變化規律，為促進真姬菇液體菌種工廠化生產提供理論依據。

1　試驗材料

1.1菌種

真姬菇菌種購自北京吉蕈園科技有限公司。供試碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，均為分析純。供試氮源為蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、尿素，均為分析純。麩皮購于張掖市市場。礦質元素為硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅，均為分析純。

1.2培養基

母種培養基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、水1 000 mL。液體種培養基為不加瓊脂的母種培養基。碳源基礎培養基為母種培養基中葡萄糖用供試碳源代替。氮源基礎培養基為母種培養基中將蛋白胨用供試氮源代替。礦質元素基礎培養基為母種培養基中將磷酸二氫鉀、硫酸鎂用供試礦質元素代替。初始pH基礎培養基為在母種培養基中用10%的鹽酸和10%的氫氧化鈉調至所需pH。

2　試驗方法

2.1液體菌種培養

將配制好的液體培養基分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入已經活化的斜面母種（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25 ℃、110 r/min恒溫振蕩培養1周。

2.2真姬菇培養特性研究

（1）不同碳源對真姬菇菌絲生長量的影響。分別稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉各20 g，溶于1 000 mL供試碳源基礎培養基后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每種碳源3次重復，經滅菌后接入5%的液體菌種，在25 ℃、110 r/min條件下恒溫振蕩培養。7天后測定菌絲生物量、菌液中殘糖量、菌液pH。

（2）不同氮源對真姬菇菌絲生長量的影響。分別稱取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、麩皮各4 g，溶于1 000 mL供試氮源基礎培養基后，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每種氮源3次重復，經滅菌后接入5%的液體菌種，25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養。7天后測定菌絲生物量、菌液中殘糖量、菌液pH。

（3）不同礦質元素對真姬菇菌絲生長量的影響。分別在礦質元素基礎培養基中加入硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸二氫鉀各0.5 g，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每處理3次重復，經滅菌后接入5%的液體菌種，25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養。7天后測定菌絲生物量、殘糖量、終止pH。

（4）初始pH對真姬菇菌絲生長量的影響。用10%氫氧化鈉溶液和10%鹽酸溶液調節母種培養基初始pH分別為2、4、6、8、10、12，將培養基分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，每處理3次重復。經滅菌后接入5%的液體菌種，在25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養。7天后測定菌絲生物量、菌液pH和菌液中殘糖量。

2.3胞外酶特性研究

（1）粗酶液的制備。在250 mL的三角瓶中加入100 mL液體培養基，每瓶接入2%的母種培養液，在25 ℃、110 r/min下恒溫振蕩培養7天。培養結束后將菌液用4層紗布過濾，取濾液10mL于離心管中，在5 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

（2）淀粉酶活性的測定。試管中加入0.5%可溶性淀粉溶液（用pH 5.8、0.2 mol/L NaAc-HAc緩沖液配置）1.5 mL，再加稀釋10倍的粗酶液0.5 mL，混勻，于38 ℃水浴鍋中保溫30 min，取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，于100 ℃水浴中煮沸5 min，冷卻后加入蒸餾水21.5 mL，混勻。用722型可見分光光度計520 nm處測OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復。酶活單位以反應前后光密度的改變值表示。

（3）羧甲基纖維素酶活性的測定。試管中加入1.5 mL用pH 4.6、0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，再加入稀釋10倍的粗酶液0.5 mL混勻，于50 ℃水浴鍋中保溫30 min，其后按淀粉酶活性測定方法操作。

（4）鄰苯二酚氧化酶活性的測定。試管中加入0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液2.0 mL及0.07 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.0）2.0 mL。再加未稀釋的粗酶液0.1 mL，混勻，于28 ℃水浴鍋中保溫30 min后，立即用722型可見分光光度計測400 nm處OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復。酶活單位以反應前后光密度的改變值表示。

（5）愈創木酚氧化酶活性的測定。試管中加入0.8 mol/L愈創木酚溶液0.5 mL及0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉（pH 4.6）緩沖液3.0 mL，再加稀釋10倍的粗酶液0.5 mL，混勻，于28 ℃水浴鍋中保溫30 min后，立即用722型可見分光光度計測490 nm處OD值；取煮沸15 min滅活的酶液做對照，每組3個重復。酶活單位以反應前后光密度的改變值表示。

3　結果與分析

3.1不同碳源菌絲的生長量

碳源主要是提供菌種生命活動所需的能量，構成菌體和代謝產物的物質基礎。不同碳源對真姬菇菌絲生長的影響見表 1。6種碳源中以可溶性淀粉的菌絲生長速度較快，為 0.7716 g/100 mL，與其他5種碳源比差異極顯著。可溶性淀粉菌絲生長速度較快的原因可能為可溶性淀粉屬于多糖，能被真姬菇菌絲更好地分解吸收利用，也可能是淀粉增加了培養基的黏度而有利于菌球的形成。此結果同文獻［4］的報道。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖為碳源，菌絲的生長速度分別為0.3669 g/100 mL、0.3289 g/100 mL、0.3141 g/100 mL、0.2396 g/100 mL，相互之間無顯著差異。甘露醇菌絲生長速度較慢，為 0.1978 g/100 mL，與其他5種碳源比有顯著差異。

表1　不同碳源與真姬菇菌絲生長的關系

3.2不同氮源的菌絲生長量

氮源主要用于構成菌體細胞物質，包括氨基酸、蛋白質、核酸，以及含氮代謝物。不同氮源對真姬菇菌絲生長的影響見表 2。6種氮源中蛋白胨的菌絲生長速度最快，為0.3669 g/100 mL，與其他5種氮源差異極顯著，這一結果同文獻［5］的報道。酵母膏與麩皮間無顯著差異，但與其他氮源差異顯著；硝酸鉀與硝酸銨之間無顯著差異，但與其他氮源比差異顯著；尿素的菌絲生長速度較慢，為0.0509 g/100 mL，與其他5種氮源比差異顯著。原因可能是尿素在分解過程中產生氨，不利于菌絲生長。

3.3不同礦質元素的菌絲生長量

6種不同礦質元素對真姬菇菌絲生長的影響差異顯著（表3），以硫酸銅的菌絲生長速度較快，為0.3607 g/100 mL，與其他5種礦質元素比差異極顯著，這一結果不同于文獻［4］的報道。原因可能與真姬菇的不同品種對礦質元素有不同的偏愛有關。硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳之間差異不顯著，但與硫酸鋅差異顯著。硫酸鋅的菌絲生長速度較慢，為0.1188 g/100 mL，與其他5種礦質元素比差異顯著。

表2　不同氮源與真姬菇菌絲生長的關系

表3　不同礦質元素與真姬菇菌絲生長的關系

3.4不同初始pH的菌絲生長量

由圖1可知，不同初始pH對真姬菇菌絲生長有影響，適宜的初始pH范圍為4～6。初始pH 為4時菌絲生長較快，為0.3339 g/100mL；初始

圖1　不同初始pH與真姬菇菌絲生長量的關系

pH為10時生長速度較慢，為0.1969 g/100 mL。

3.5酶活性測定

（1）淀粉酶活性。由圖 2可知，在整個發酵培養試驗期內，淀粉酶均有活性，在第4天時活性達到高峰。這是因為菌絲生長初期胞外酶分泌較少，能利用的主要是培養基中的小分子碳源。隨著菌絲的生長和胞外酶的分泌，淀粉酶活性逐漸升高達到高峰。隨著培養時間的繼續延長，淀粉含量又復減少，酶活隨之逐漸下降，這一結果與文獻［6］的報道一致。

圖2　淀粉酶活性與培養時間的關系

（2）羧甲基纖維素酶活性。從圖 3看，在整個發酵培養試驗期內，羧甲基纖維素酶均有活性，在第2天時達到高峰，之后迅速降低，到第6天時最低；而到第7天又上升第二個高峰。

圖3　羧甲基纖維素酶活性與培養時間的關系

（3）鄰苯二酚氧化酶活性。圖 4表明，在整個發酵培養試驗期內，鄰苯二酚氧化酶均有活性。開始時，鄰苯二酚氧化酶的活性上升速度較快，到第3天達第一個峰值；之后活性下降，第5天降到最低值；之后又復上升，這一結果與文獻［7］的報道相類似。

圖4　鄰苯二酚氧化酶活性與培養時間的關系

（4）愈創木酚氧化酶活性。圖5表示在整個發酵培養試驗期內，愈創木酚氧化酶均有活性，活性第一個高峰出現在培養的第2天；之后開始下降，第4天開始又上升，培養到第7天時，達到第二個高峰。這一結果與文獻［8］的報道相似。

圖5　愈創木酚氧化酶活性與培養時間的關系

4　討論與結論

真姬菇液體培養適宜的碳源是可溶性淀粉，原因可能是真姬菇菌絲能分泌淀粉酶，能更好分解吸收利用淀粉；也可能是淀粉增加了培養基的黏度而有利于菌球的形成。最佳氮源是蛋白胨，在有機氮中菌絲生長速度比在無機氮中快。真姬菇液體培養的最佳礦質元素是硫酸銅，這與其他食用菌不同，可能是品種特性所致。適宜生長的最適pH為4～6，與其他食用菌相似。

在整個發酵期內，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創木酚氧化酶的酶活性高峰交替出現。其中愈創木酚酶、羧甲基纖維素酶活性第一次高峰出現較早，為第2天；其次是鄰苯二酚酶，在第3天；淀粉酶活性在發酵培養的第4天出現。無論是自然界生長的還是人工栽培的食用菌，其生存環境中的主要碳源是纖維素、半纖維素、木質素和淀粉等大分子有機物［8］。真姬菇菌絲在發酵培養前期主要利用糖類、纖維素，而后期則主要利用木質素。

參考文獻

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Study on Hypsizygus marmoreus characteristics and extracellular enzyme activity in submerged culture

Zhang Wenbin1Li Wende1Wang Zhijiang2*Wang Shaoqiu2
（（1. Zhangye Economic Crops Extending Stations， Zhangye， Gansu 734000；2.Institute of Agricultural and Biological Technology， Hexi University， Zhangye， Gansu 734000））

AbstractSubmerged culture was used to determine the effects of different carbon sources， nitrogen sources， mineral elements and original pH value of mycelial's growth. The results showed that the best carbon source was melted amylon，the best nitrogen source was peptone， the best mineral elements was CuSO4and the best original pH value was 4～6 in all submerged culture period， activity peaks of amylase， carboxy menthel cellulose， polyphenol oxidase and guaiacol oxidase appear with difference. Guaiacol oxidase activity appers peak at the second day. The next is polyphenol oxidase appers at the third day. And， amylase， carboxy menthel cellulose appears at the fourth day.

Key WordsHypsizygus marmoreus； submerged culture； characteristics； extracellular enzyme activity

中圖分類號：S646

文獻標識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）01-043-05

基金項目：甘肅省特色產業科技攻關項目；項目編號Gs2014scgg-05（2）

作者簡介：張文斌（1966—），推廣研究員，主要從事設施蔬菜栽培技術研究與示范工作。E-mail：zhang-wb882003@ yahoo.com.cn

*通訊作者：王治江（1965—），高級實驗師，主要從事食用菌栽培與產業化開發工作。E-mail：wangzhijiang0772@163.com