姜黃素PLGA納米粒的制備及制劑學性質分析

李晴宇，葉曉莉，陳　玲，王彬輝，樓　江，王國偉，嚴　偉*

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姜黃素PLGA納米粒的制備及制劑學性質分析

李晴宇1，葉曉莉1，陳玲1，王彬輝2，樓江1，王國偉3，嚴偉1*

1.杭州市第一人民醫院，杭州 310006；2.臺州市立醫院，臺州 318000；3.浙江中醫藥大學，杭州 310053

[摘要]目的制備姜黃素(Curcumin，Cur)聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)納米粒(Cur-PLGA-NPs)并對其理化性質進行考察。方法采用改良的自乳化溶劑揮發法制備納米粒，通過正交設計，以粒徑、包封率和載藥量為評價指標優化處方工藝。結果制備Cur-PLGA-NPs的優化條件為PLGA 100 mg，泊洛沙姆188濃度1.0%，丙酮與乙醇體積比3∶1，有機相體積15 mL。按優化條件所制備的Cur-PLGA-NPs粒徑為(120.33±2.44)nm，多分散系數為0.10±0.02，包封率為84.50%±1.13%，載藥量為4.75%±0.22%。結論采用改良的自乳化溶劑揮發法成功制備了Cur-PLGA-NPs，為后續“納米粒-脂質體系統”的研究奠定了基礎，有望實現藥物在肝臟的濃集。

[關鍵詞]姜黃素；納米粒；聚乳酸羥基乙酸共聚物；正交設計

0引言

姜黃素(Curcumin,下稱Cur)是從姜黃的根莖中提取出來的一種多酚類化合物[1]，素有“破血行氣，通經止痛”之功效。現代研究發現，姜黃素還可通過誘導腫瘤細胞凋亡、改變細胞受體連接和調控細胞凋亡信號來抑制肝腫瘤細胞的產生、增殖和轉移[2-3]，常用于肝癌等的治療。姜黃素以其價格低廉、對人體毒副作用小[4]被美國國立腫瘤研究所列為第3代抗癌化學預防藥[5]。但由于姜黃素水溶解度低，不易進入肝細胞，并且藥物在體內代謝迅速，使腫瘤病灶區藥物濃度很快失去抗腫瘤活性，限制了其臨床發展[6]。研究表明，制備高效低毒制劑是提高姜黃素應用價值的一種重要且方便的手段。

目前，具有“魔法子彈”之說的納米粒(Nanoparticles，NPs)已廣泛用于裝載抗腫瘤藥物，通過胞飲或吞噬作用進入細胞，繞過細胞膜上P-糖蛋白等外排泵對藥物的外排作用[7]。但由于納米粒易降解，研究表明，脂質體包裹納米粒可以保護納米粒，提高其穩定性，改善藥動學[8-9]。因此，本實驗以聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid) copolymer，PLGA]為載體材料，制備Cur-PLGA-NPs，并通過單因素和正交試驗來優化工藝，為構建脂質體包裹姜黃素納米粒的載藥系統提供實驗基礎。

1儀器與試藥

LC-2010CHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Nano-ZS型粒徑分析儀(英國Malvern公司)；超速離心機(美國Beckman公司)；RE52CS-1型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。Cur原料藥(成都普思生物技術有限公司，純度>98%，批號：12041502)；Cur對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量98.8%，批號：110823-201004，含量測定用HPLC)；PLGA(山東省醫療器械研究所，Mw為20 000)；泊洛沙姆188(德國BASF公司，批號：WPWA544C)；乙腈為色譜醇；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1姜黃素含量測定

2.1.1色譜條件色譜柱：Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(60∶40，磷酸調pH值至3.0)；體積流量：1 mL/min；檢測波長：425 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL[10]。

2.1.2專屬性考察制備空白PLGA-NPs和Cur-PLGA-NPs混懸液。取Cur標準品溶液、空白PLGA-NPs和Cur-PLGA-NPs混懸液進行HPLC分析。結果見圖1。Cur色譜峰專一性良好，輔料和溶劑對其測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖

2.1.3標準曲線的建立精密稱取Cur對照品適量，用甲醇定容，得到121.6 μg/mL的Cur對照品儲備液。分別用甲醇配制系列質量濃度為5.06、10.14、20.26、30.41、40.56、50.71、60.80 μg/mL的溶液，按“2.1.1”項色譜條件測定，以峰面積(Y)對藥物濃度(X)進行線性回歸，得標準曲線方程：Y=192 788 X-3 172.6，r=0.999 9(n=7)。表明Cur在5.06～60.80 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4精密度與回收率試驗取Cur濃度分別為4.90、29.39、58.77 μg/mL的對照品溶液，于1 d內測定6次，進行日內精密度試驗，RSD值為0.17%。

精密稱取處方量80%、100%、120%減壓干燥至恒重的Cur標準品，分別加處方比例輔料，用甲醇定容為17.91、22.39、26.87 μg/mL的低、中、高濃度溶液，按“2.1.1”項色譜條件分析，計算回收率。結果見表1。

2.1.5重復性試驗取同批次制備的Cur-PLGA-NPs混懸液6份，制備供試品溶液，進樣測定峰面積，計算其RSD為0.21%。

表1　方法回收率(n=6)

2.2Cur-PLGA-NPs的制備取適量Cur和PLGA溶于一定比例的丙酮與乙醇混合溶劑中，構成有機相；另取處方量的泊洛沙姆188水溶液，構成水相。攪拌下將有機相恒速滴加到水相中。繼續攪拌10 min后，旋轉蒸發除去有機溶劑，得Cur-PLGA-NPs膠體溶液。

2.3指標考察

2.3.1納米粒形態學考察取適量Cur-PLGA- NPs膠體溶液滴于銅網上，滴加2.0%磷鎢酸溶液于銅網上負染，透射電子顯微鏡觀察。

2.3.2納米粒粒徑測定用適量水稀釋Cur-PLGA-NPs混懸液，Nano-ZS型粒徑分析儀測定。

2.3.3納米粒包封率與載藥量測定取Cur-PLGA-NPs混懸液超速離心(40 000 r/min，4 ℃)30 min，取上清液1 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經0.22 μm微孔濾膜濾過，續濾液測定Cur含量，記作W1；取離心后沉淀物，蒸餾水洗滌3次，真空冷凍干燥后精密稱定總質量，記作W。另取1 mL Cur-PLGA-NPs至10 mL量瓶中，加甲醇超聲定容，按同法測定NPs中Cur的總含量，記作W0，分別計算包封率和載藥量。包封率=(W0-W1)/W0，載藥量=(W0-W1)/W。

2.4單因素考察

2.4.1載體材料分子量選擇PLGA載體材料分子量為5 000、20 000、30 000 Da，按“2.2”項方法制備Cur-PLGA-NPs。結果表明，當PLGA的分子量不斷增大時，NPs粒徑和多分散系數(Polydispersity index，PDI)都呈增加趨勢，可能是由于PLGA鏈段的長度隨著PLGA分子量增大而增長，導致分子鏈間的作用增強，有機相黏度變大，粒子較難擴散，故所得的粒徑較大。同時大分子量PLGA降解時間延長，小分子量PLGA會導致成球性越差。綜合考慮，本實驗選擇20 000 Da的PLGA作為NPs的載體材料。

2.4.2攪拌條件固定其他實驗條件不變，選擇攪拌速度分別為200、500、800 r/min，攪拌時間分別為5、10、15 min，進行考察。結果表明，攪拌過慢則體系分散性較差；過快易產生較多泡沫。而攪拌時間對NPs粒徑和PDI的影響均不顯著，故本試驗選擇攪拌速度為500 r/min，攪拌時間為10 min。

2.4.3Cur用量選擇投藥量分別為2、5、10 mg，結果表明，隨著藥量增大，粒徑和PDI呈增大趨勢。但當投藥量增至10 mg時，溶液已達到飽和狀態，出現絮狀沉淀，靜置后分層，故本實驗選擇Cur的用量為5 mg。

2.5Cur-PLGA-NPs最佳處方工藝本實驗根據單因素考察結果，選擇PLGA用量(A)、泊洛沙姆188質量分數(B)、丙酮與乙醇的體積比(C)、有機相體積(D)為考察因素，每個因素選取3水平，按L9(34)進行正交試驗。以納米粒粒徑、包封率和載藥量綜合加權評分值為指標，篩選最佳處方。

3結果

3.1正交試驗以綜合加權評分法對正交結果進行綜合分析，粒徑(y1)、包封率(y2)和載藥量(y3)分別按35%、30%、35%的系數計分，綜合評分值(y)=35×(1-y1/209.5)+30×y2/86.41+35×y3/6.05。結果見表2～表4。極差分析結果可知，各因素對納米粒粒徑、包封率和載藥量綜合評分值的影響程度依次為：A>B>D>C。由表5可知，影響因素A、B、D對粒徑、包封率和載藥量影響顯著(P<0.05)，而C對三者影響不顯著。綜合極差分析和方差分析確定Cur-PLGA-NPs的最佳制備工藝為A1B1C1D2，即PLGA用量為100 mg，泊洛沙姆188質量分數為1.0%，丙酮與乙醇體積比為3∶1，有機相體積為15 mL。

表2　正交試驗因素水平表

表3　正交試驗設計和結果

表4　方差分析

3.2最佳工藝驗證按“3.1”項下Cur-PLGA-NPs優化的處方工藝制備3批納米粒混懸液，分別測定粒徑、多分散系數、包封率和載藥量，結果見表5。粒徑、多分散系數、包封率和載藥量分別為(120.33±2.44)nm、0.10±0.02、84.50%±1.13%、4.75%±0.22%(n=3)。納米粒呈類圓形，大小及分布均勻，粒子間未見黏連和聚集現象，結果見圖2。取適量NPs混懸液，蒸餾水稀釋后粒徑分析儀測定平均粒徑，結果見圖3。

表5　驗證試驗結果

圖2　Cur-PLGA-NPs透射電鏡照片(×50 000)

圖3　Cur-PLGA-NPs粒徑分布

4討論

本實驗通過改良的自乳化溶劑揮發法制備納米粒，采用丙酮和乙醇對藥物、聚合物和分散劑三者不同的溶解度，以溶劑自發擴散的形式來制備Cur-PLGA-NPs。制備實驗過程中，分別采用注射器、滴液漏斗和直接加入3種方式滴加有機相，結果表明，使用針頭和滴液漏斗能得到較小粒徑且分布均勻的納米粒。可能是由于直接加入有機相的方式往往較難控制滴速，使有機相在水相中分布不均勻而分層，不利于納米粒的包裹。而滴液漏斗和針頭則以恒定的速度勻速滴加至水相，充分在水相中完全分布，有利于納米粒的成型和粒徑分布，通過實驗發現滴液漏斗滴加制備得到的納米粒粒徑比注射器滴加更小，更均勻。故本實驗選擇滴液漏斗滴加的方式加入有機相。

正交試驗結果表明，有機相體積和泊洛沙姆188濃度對NPs的粒徑、包封率和載藥量均具有顯著影響。固定水相的體積，隨著有機相體積增加(5～15 mL)，NPs的粒徑和PDI逐漸減小。因為在PLGA用量固定的情況下，PLGA的濃度隨著有機相體積的增大而逐漸降低，黏度降低，納米粒更易分散。但是隨著有機相體積增加(15～35 mL)，NPs的粒徑和PDI則逐漸增大，可能是由于有機相的體積不能超過水相，否則會造成納米粒不易分散，甚至乳滴間團聚[11]。制備穩定的納米粒，表面活性劑的選用也很重要。本實驗使用的表面活性劑泊洛沙姆188不僅具有空間位阻效應，抑制納米粒聚集，增加溶液的穩定性；還可避免被網狀內皮系統吞噬和抑制多藥耐藥相關蛋白的外排[12]。在實驗過程中發現泊洛沙姆188在一定用量范圍內，表面張力隨著濃度增加而降低，使有機相在水相中分散，且在NPs表面形成一層親水性膜，故NPs團聚的機會減少，粒徑減小。但隨著表面活性劑濃度進一步增大(>1.0%，w/v)，其不能起到乳化作用，還會造成外水相過于黏稠，使NPs聚集，粒徑增大，甚至出現嚴重的“突釋”現象[13]。

納米靶向治療是以納米粒為運輸載體，將藥物定向作用于靶器官，從而達到增效減毒的作用。研究表明，血管內給藥，粒徑100～200 nm的微粒系統能快速被網狀內皮系統中的巨噬細胞從血液中清除，最終達到肝枯否細胞溶酶體中。本實驗制備的納米粒粒徑為120 nm，滿足肝靶向的粒徑要求，同時也為進一步研究“納米粒-脂質體系統”肝癌靶向治療的體內行為、細胞行為和肝靶向機制奠定了良好的基礎。

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Preparation of curcumin-loaded poly (lactic-co-glycolic acid) nanoparticles and analysis of its nature

LI Qing-yu1,YE Xiao-li1,CHEN Ling1,WANG Bin-hui2,LOU Jiang1,WANG Guo-wei3,YAN Wei1*

(1.Hangzhou First People′s Hospital,Hangzhou 310006,China;2.Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

[Abstract]ObjectiveTo prepare the curcumin poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer (PLGA) nanoparticles (Cur-PLGA-NPs)and to investigate its nature.MethodsThe Cur-PLGA-NPs were prepared with modified solvent evaporation method and were optimized through orthogonal test according to particle size,entrapment efficiency and drug loading of Cur-PLGA-NPs.ResultsThe optimal conditions for preparation of Cur-PLGA-NPs included 100 mg PLGA,1.0% poloxamer 188 (m/V),acetone/ethanol 3∶1 (V/V) and 15 mL organic phase.The mean particle size of the resulted Cur-PLGA-NPs was (120.33±2.44) nm and the polydispersity index (PDI) was 0.10±0.02,and the average entrapment efficiency and drug-loading was 84.50%±1.13% and 4.75%±0.22%,respectively.ConclusionAn optimized nanoparticles drug delivery system is obtained by modified solvent evaporation method,which provides foundation for the further research of lipid-coated nanoparticles.

Key words：Curcumin;Nanoparticles;Poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer;Orthogonal design

收稿日期：2015-10-10

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606027