鞘內注射右美托咪定增加神經元自噬改善大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經運動功能

李曉倩，方　波，馬　虹

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鞘內注射右美托咪定增加神經元自噬改善大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經運動功能

李曉倩，方波，馬虹*

中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，沈陽 110001

[摘要]目的觀察注射右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)預處理對在體大鼠脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)后神經元自噬和下肢運動功能的影響。方法SD大鼠隨機分為4組(每組30只)：假手術組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組，鞘內注射30 μL生理鹽水)、Dex組(缺血前3 d鞘內注射右美托咪定10 μg/30 μL)、Dex+ATIP組(缺血前3 d鞘內注射10 μg右美托咪定+10 μg阿替美唑共30 μL)。Sham組僅暴露主動脈弓而不結扎，其他各組開胸后無創動脈夾夾閉主動脈弓14 min后再開放，建立SCIRI模型。各組手術前均于L5-6鞘內置管并連續注射3 d。損傷后48 h內每12 小時取5只大鼠，采用Tarlov法評價大鼠下肢運動功能；HE染色觀察和計數損傷后48 h脊髓前角神經元形態和數量；Western blot和RT-PCR法測定損傷后48 h大鼠脊髓組織中自噬相關蛋白Beclin1、LC3蛋白及mRNA含量。結果與Sham組比較，術后各觀察點IR組下肢運動功能明顯受損，Tarlov評分下降，脊髓組織中Beclin1、LC3蛋白及mRNA的表達均明顯降低(P<0.05)；損傷前3 d鞘內注射10 μg DEX(Dex組)可改善缺血再灌注損傷后下肢運動功能，提高Tarlov評分，改善脊髓Beclin1、LC3 mRNA蛋白的表達(P<0.05)，而Dex+ATIP組與IR組比較差異無統計學意義(P>0.05)。損傷后48 h，HE染色顯示，Sham組脊髓前角神經元輪廓清晰，結構完整，無出血、水腫等異常表現；IR組、Dex+ATIP組細胞質中的尼氏體消失，神經元胞核出現固縮或溶解，廣泛空泡形成；而Dex組神經元形態明顯規整，且正常神經元數量增多。結論鞘內注射右美托咪定預處理通過上調Beclin1、LC3蛋白和基因表達，增加神經元自噬，改善大鼠缺血再灌注后下肢運動功能。

[關鍵詞]鞘內注射；右美托咪定；自噬；Beclin1；LC3

0引言

脊髓缺血再灌注損傷(Spinal ischemia reperfusion injury，SCIRI)在臨床常見于脊柱手術、動脈瘤手術、血管畸形手術以及心臟手術體外循環期間等，損傷平面以下感覺和運動缺失，引起四肢癱瘓、截癱，甚至死亡，嚴重影響患者預后，造成巨大的經濟和社會負擔[1-3]。目前SCIRI病理學機制研究已成為現代醫學和神經科學領域的難題和熱點。如何有效地防治和最大限度地降低圍術期SCIRI的發生率，保護神經功能，降低術后并發癥，對改善患者的生存質量和降低醫療成本，均具有重要意義。自噬(Autophagy)是亞細胞膜結構發生動態變化并經溶酶體介導對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程。近年研究表明，自噬現象廣泛存在于腦缺血、腦卒中等神經系統疾病中，參與并影響了神經系統疾病的病理生理過程[4-5]。正常情況下，自噬處于一個低水平表達的狀態；但當某些病理情況下，如缺血缺氧時，自噬可被迅速激活，通過平衡細胞合成和分解代謝，維持缺血再灌注后細胞的存活[6-7]。目前自噬在SCIRI領域的相關研究甚少。

右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)是一種新型高選擇性腎上腺素能受體(α2AR)激動劑，具有鎮靜、鎮痛和抗焦慮等作用[8]。越來越多的研究證實，全身和鞘內注射右美托咪定可抑制脊髓感受傷害性反應，激活神經系統相關保護信號通路，具有神經修復作用[9-10]。本研究旨在觀察鞘內注射右美托咪定對SCIRI后大鼠下肢運動功能、脊髓組織中自噬相關蛋白Beclin1和微管相關蛋白1的輕鏈(LC3)表達的影響[11]。

1儀器與試藥

雄性Sprague-Dawley大鼠120只，體重250～280 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。HE染液套盒(珠海貝索生物技術有限公司)；兔抗Beclinl多克隆抗體，兔抗LC3單克隆抗體(購自武漢博士德)；One step RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；圖像分析系統(武漢華海公司，HIPAS-1000型)；酶標儀(美國BIO-TEK公司，EIx800型)。

2實驗方法

2.1實驗分組大鼠隨機分為4組，每組30只。非假手術組參照文獻[2-3]制備脊髓缺血再灌注模型，并行L5-6鞘內置管。假手術組(Sham組)：脊髓缺血前3 d鞘內注射生理鹽水30 μL；缺血再灌注損傷組(IR組)：同Sham組；鞘內右美托咪定預處理組(Dex組)：缺血前3 d鞘內注射10 μg DEX (30 μL)；Dex+ATIP組：缺血前3 d鞘內注射右美托咪定10 μg+阿替美唑10 μg(共30 μL)。1次/d，連續3 d。

2.2大鼠SCIRI模型的建立[2-3]水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，常規消毒，右側臥位，四肢固定于手術臺上，胸背部去毛，消毒鋪巾。沿肋緣切口逐層分離并暴露左肺上葉，面紗條肺部保護后由心包處開始分離主動脈，至主動脈弓左鎖骨上動脈發出處上無創動脈夾夾閉14 min，之后撤除動脈夾，逐層縫合傷口。腹腔注射0.3 mL氨芐青霉素(100 mg/mL)。術后單籠飼養。

2.3神經運動功能評價以改良的Tarlov評分標準對下肢運動功能進行評價。0分：沒有可覺察的下肢活動；1分：有可覺察的關節自主活動；2分：后肢可自由活動，但無法站立；3分：可站立，但無法行走；4分：后肢功能完全恢復，能正常行走。

2.4脊髓組織病理學檢查(HE染色)完成神經行為學評分后處死大鼠，切除L3-4椎板，暴露L5-6節段硬膜囊，切斷周圍神經根；分離脊髓組織，10%甲醛固定48 h，分節段石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后采用光學顯微鏡觀察，計數脊髓前角正常神經元數目，觀察神經元損傷情況。

2.5Western blot測定大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3的蛋白表達提取組織蛋白質樣品，電泳轉移至PVDF膜上，分別加入兔抗LC3單克隆抗體(1∶500)、兔抗Beclinl多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，洗膜后再用HRP標記的山羊抗兔IgG雜交，37 ℃ 2 h，ECL試劑X線膠片顯像，掃描，以與β-actin的比值作為表達強度。

2.6RT-PCR測定大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3的mRNA表達按試劑盒說明書操作。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測提取總RNA的質量和濃度。引物序列如下：Beclin1：5′-GACCGAGTGACCATTCAGGAAC-3′(正向)，5′-GGTTCTCCATGGTGCCACCATCAG-3′(反向)；LC3：5′-GCACCATGCCGTCGGAGAAGACC-3′(正向)，5′-CACTCCTAGGTGGGAACACTACTG-3′(反向)；GAPDH：5′-TCGGCATTGTGGAGGGGCTC-3′(正向)，5′-TCCCGTTCAGCTCGGGGATG-3′(反向)。在FTC2000型熒光定量PCR儀上行PCR。擴增條件如下：①94 ℃1 min，②94 ℃10 s，③55 ℃30 s，④72 ℃1 min，45個循環。退火期為55 ℃ 30 s。結束后，系統根據各反應管的熒光強度增長指數(DRn)繪制擴增動力學曲線，確定至特定闡值時的擴增循環數(Ct值)，采用2-△△CT法處理數據。

3結果

3.1神經運動功能評價與Sham組比較，其余三組大鼠術后各觀察點(尤以48 h為著)Tarlov評分均明顯降低(P<0.05)；與IR組比較，Dex組各時間點Tarlov評分明顯升高(P<0.05)；Dex+ATIP組與IR組各時間點評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1　缺血再灌注后大鼠下肢運動功能(Tarlov評分)變化(n=6)

3.2對脊髓組織結構的影響光鏡下觀察損傷后48 h脊髓組織病理變化，可見Sham組脊髓前角神經元輪廓清晰，細胞呈多角形，細胞核結構清晰，細胞質中可見尼氏體，無出血、水腫等異常；IR組、Dex+ATIP組中神經元胞體皺縮或溶解，胞質中的尼氏體消失，廣泛空泡形成，炎性細胞浸潤，正常運動神經元數目明顯減少；Dex組神經元外觀介于Sham組和IR組之間，可見神經元極性變鈍，但結構相對清晰，可見到尼氏體。各組脊髓缺血再灌注損傷程度和脊髓前角正常神經元數目計數見圖2。

圖2　鞘內注射DEX對SCIRI導致脊髓組織病理變化和前角正常神經元計數(400×)

3.3Western blot測定脊髓組織中自噬相關蛋白Beclin1和LC3的含量與Sham組比較，術后48 h，IR組大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Dex組中表達明顯增加(P<0.05)；而IR組和Dex+ATIP組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

3.4RT-PCR法測定脊髓組織中Beclin1和LC3 mRNA的含量與Sham組比較，術后48 h，IR 組大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，Dex組中表達明顯增加(P<0.05)；而IR組和Dex+ATIP組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

4討論

SCIRI是指短暫缺血脊髓在恢復血液再灌注后，組織細胞功能代謝障礙及結構功能破壞反而加重的現象。炎癥反應、神經元凋亡是SCIRI的主要特征[2-4,12]。DEX是新一代α2腎上腺素受體激動劑，通過激動腦干藍斑，產生鎮靜、催眠、鎮痛以及抑制交感興奮、穩定血流動力學效應，在臨床中廣泛應用。最近研究發現，DEX在腦和心肌缺血再灌注損傷中可以通過降低血漿中兒茶酚胺的濃度、抑制凋亡相關蛋白，發揮神經保護作用[13-14]。但對其在SCIRI的神經保護作用的研究較少。越來越多的研究表明，全身和鞘內注射右美托咪定可抑制脊髓感受傷害性反應和激活神經系統相關保護信號通路，具有神經修復作用[9-10]。因此，本研究通過鞘內注射DEX，觀察其對SCIRI后下肢運動功能的影響，探討其發揮神經保護的可能機制。

圖3　Weston blot測定脊髓組織中自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達

圖4　RT-PCR測定脊髓組織中自噬相關蛋白Beclin1和LC3 mRNA

無創動脈夾夾閉主動脈弓模擬SCIRI是目前應用最廣泛的動物模型之一，具有高度的重復性[2-3,9]。本實驗觀察顯示，IR組大鼠術后各觀察點Tarlov評分較Sham組降低，提示SCIRI可以引起下肢運動功能障礙。本研究中，Tarlov評分在術后48 h降低最明顯，因此，選擇術后48 h對脊髓組織進行病理學等的檢查。HE染色結果顯示，IR組神經元形態缺失，炎癥和空泡化明顯，脊髓前角正常神經元數目明顯減少，而Dex組神經元形態基本完好，提示運動功能下降與神經元損傷密切相關，鞘內注射DEX可以維持運動神經元的形態和功能，且可被其特異性阻滯劑阿替美唑所抑制。

自噬廣泛存在于真核細胞中，通過自噬溶酶體進行多種酶的消化及降解，維持細胞的自身穩態，凈化自身多余或受損細胞[4,7]。正常情況下，自噬處于一個低水平表達的狀態，適量自噬表達時，自噬體數量處于溶酶體的降解能力范圍內，此時自噬的主要功能是為細胞提供能量，促進細胞存活[4,15]。病理情況下，細胞處于缺血缺氧狀態，細胞內的三磷酸腺苷濃度迅速下降，引起單磷酸腺苷激活的蛋白激酶促進自噬形成，維持細胞功能[15]。既往研究發現，自噬參與腦缺血性和出血性疾病過程，影響了神經細胞的生存和死亡，且自噬途徑的激活可能是缺血損傷早期的一種潛在的保護機制[7]。Beclin1和LC3是自噬相關的標記蛋白。Beclin1可以參與自噬體的形成，調節其他自噬蛋白在自噬前體膜的定位，是維持自噬/凋亡負反饋平衡的關鍵[16]，而LC3Ⅱ則直接反映自噬發生程度[7]。本實驗從蛋白和核酸水平證實，損傷后48 h，與Sham組比較，IR組Beclin1和LC3Ⅱ表達下降，而Dex組LC3Ⅱ表達明顯上升，提示鞘內注射DEX可以誘導自噬發生，發揮神經保護作用，與郭倩等[17]研究結果一致。

綜上所述，本研究通過觀察鞘內注射右美托咪定對SCIRI模型中大鼠行為學、脊髓病理學、Beclin1和LC3蛋白、基因表達的影響，證實SCIRI損傷中可能存在自噬途徑，鞘內注射DEX可以通過提高自噬相關蛋白Beclin1和LC3表達，提高Tarlov評分，改善下肢運動功能，揭示Dex對SCIRI發揮神經保護作用的潛在新機制，為臨床改善脊髓損傷預后提供了新的治療靶點。

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Intrathecal injection with dexmedetomidine to improve neural motor function in rats with spinal cord ischemia reperfusion injury

LI Xiao-qian,FANG Bo,MA Hong*

(Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of intrathecal injection with dexmedetomidine on neuropathic autophagy and lower extremities motor function in rat model of spinal cord ischemia reperfusion injury (SCIRI).MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups(n=40):Sham group,IR group,Dex group and Dex+ATIP group.The NS 30 μL,DEX 10 μg (30 μL) and DEX 10 μg+atipamezole 10 μg (30 μL)was administered intrathecally for 3 d before surgery in IR group,Dex group and Dex+ATIP group,respectively.The lumbar intrathecal catheters were implanted in L5-6of rats and SCIRI models were established by aortic arch occlusion for 14 min.The lower extremities motor function was assessed by Tarlov scores.HE staining was performed for observing the neuronal morphology and counting the number of normal neurons in anterior horn of injured spinal cord at 48 h after IR.The spinal mRNA and protein expressions of Beclin1 and LC3 were assessed by Western blot and real-time PCR.ResultsCompared with Sham group,the lower extremities motor function in IR group was injured,and the Tarlov scores were decreased with lower expression of mRNA and protein of Beclin1and LC3 in spinal cord at 48 h after injury.Intrathecal injection with dexmedetomidine(Dex group) could increase the Tarlov scores,and improve the lower extremities motor function after ischemia reperfusion injury and the expression of mRNA and protein of Beclin1 and LC3 in the spinal cord(P<0.05),while no significant difference was observed between Dex+ATIP group and IR group.HE staining showed that Sham group had clear outline and complete structure of spinal cord anterior horn motor neurons without abnormal appearance of bleeding or edema at 48 h after IR injury.The Nissl substance in IR group and Dex+ATIP group disappeared with condensation or dissolution in nucleus of neurons and wide cytoplasmic vacuolating formation.The shape of neuron in Dex group was clear,and the number of normal neuron increased.ConclusionIntrathecal injection with dexmedetomidine can enhance the neuron autophagy,improve the lower extremities motor function after ischemia reperfusion injury by up-regulating the expression and protein of Beclin1 and LC3 in spinal cord.

Key words：Intrathecal injection;Dexmedetomidine;Autophagy;Beclin1;LC3

收稿日期：2016-01-14

基金項目：遼寧省科學技術計劃項目(2012408002)；國家自然科學基金(81271370)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606002