馬鈴薯早疫病菌Alternaria alternata交配型異型體MAT1-1和MAT1-2不同的致病力研究

蒙靜雯，謝業焜，沈林林，李冬亮，祝 雯，詹家綏

（1.福建農林大學植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000）

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馬鈴薯早疫病菌Alternaria alternata交配型異型體MAT1-1和MAT1-2不同的致病力研究

蒙靜雯1，2，謝業焜1，沈林林1，李冬亮1，祝 雯1，詹家綏1

（1.福建農林大學植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000）

摘 要：從全國7個省份（黑龍江、內蒙古、山東、河南、湖北、福建和云南）收集Alternaria alternata，采用SSR中性分子標記和交配型特異性引物測定菌株并選出234株不同基因型的菌株，再用離體葉片法測量菌株的致病力（病斑面積）。結果表明，7個群體中來自南方群體比來自北方群體致病力強，其中福建群體比山東群體的致病力高98.29%。MAT1-1交配型菌株和MAT1-2交配型菌株之間致病力存在顯著差異，MAT1-2交配型菌株致病力比MAT1-1交配型菌株平均高15.34%。

關鍵詞：Alternaria alternata；馬鈴薯早疫??；致病力；交配型；離體鑒定

在自然條件下，真菌可以通過無性、有性、準性和異核等一系列生殖模式在世代間傳遞遺傳物質［1］，這些不同生殖模式對真菌本身種群結構、進化方向以及病害流行有著不同的影響［2］。真菌的生殖模式由交配型基因（MAT）調控，該基因由基因組保守區的基因簇組成編碼與性發育相關的多種蛋白［3-4］。對于許多異宗配合的真菌來說，有性生殖是由一個MAT1基因調控的，該基因編碼兩種不同的異型體（idiomorphs）MAT1-1 和MAT1-2，異型體間核酸序列缺乏相似性，編碼不同的結構蛋白［4-6］。

動植物的性別由性染色體決定，雖然真菌的性識別機理還不清楚，但其交配型基因區域中存在類似于動物性染色體上發生的基因異位或者重排的現象，說明真菌和動物在性別識別上可能具有相似的進化特點［7］。動物的雌性和雄性受到性染色體直接或者間接的影響，在形態和生理上存在差異，但真菌不同交配型是否存在形態、生理和生態特征的差異有待進一步探討。部分研究表明有的真菌不同交配型的菌株在致病力、細胞生長和維持細胞壁完整性的特征上存在一定差異［3，8-9］。例如在農業上，小麥葉枯病菌（Zymoseptoria tritici）MAT1-1交配型菌株致病力比MAT1-2交配型菌株致病力高［10］，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）MAT1-1交配型比MAT1-2交配型有更強的侵染力［11］；在臨床醫學，新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）α交配型菌株比a交配型菌株致病力更高［12］。

Alternaria alternata屬鏈格孢屬菌，在世界各地都可以引起早疫病害［13-16］。在自然條件下尚未發現早疫病菌有性生殖過程，因此一直被劃分為無性生殖真菌，但這種真菌仍然攜帶有兩個不同異型體MAT1-1 和MAT1-2的MAT1基因，控制有性生殖行為和有性孢子的產生［5-6］。Arie等［5］用PCR方法從A. alternata中克隆交配型MAT1基因序列，利用側翼區域將MAT1-2異型體全長測序，發現MAT1-2蛋白中保守的high mobility group （HMG）區域，同時利用側翼區域設計引物擴增相反MAT1-1異型體。發現MAT1-1異型體至少包含1個假定alpha box區域蛋白基因的編碼區，MAT1-2異型體至少包含1個假定HMG box區域蛋白基因的編碼區。通過異源表達，在A. alternata的近緣種Cochliobolus heterostrophus 中證明MAT1基因有功能。

在自然條件下我國A. alternata 群體兩種不同交配型異型體的時空頻率分布呈等比例分布［17］，與之前報道的結果一致［18-19］，說明該病原在自然條件下可能存在隱性有性生殖，兩種交配型菌株有同樣的機會侵染寄主。本試驗分析比較A. alternata的致病力，研究交配型基因除了決定真菌的性行為外，是否還具有其他生理生化作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病葉收集 2011—2013年在我國7個省份（黑龍江、內蒙古、山東、河南、湖北、福建和云南）收集有黑褐色同心圓壞死斑癥狀的馬鈴薯早疫病病葉［15］，間隔1～2 m隨機采樣，每株植株上摘取1片病葉。

1.1.2 病原菌分離純化 收集的病葉用流動的自來水沖洗后晾干，用75%酒精表面消毒2 min，再用無菌水反復洗3次，除去葉片表面水分，置于1%的水瓊脂（瓊脂粉10 g/L）培養基中保濕培養。在25℃培養24 h后挑取病斑長出的菌絲，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L和瓊脂18 g/L）上培養，25℃條件下培養5 d左右。對培養出來的菌絲做單孢分離，置于PDA培養基上培養，完成純化。

1.1.3 病原菌鑒定和培養 使用光學顯微鏡進行真菌形態學觀察［16，20］和采用真菌通用引物ITS1 和ITS4進行PCR擴增并測序。引物序列：ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。收集純化后的菌絲提取DNA。經過形態學和分子生物學方法，檢測鑒定為A. alternata。

1.1.4 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、2×Taq PCR Master Mix、DNAMarker100bp均購于北京全式金公司，2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye）購自北京Transgen 生物科技有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Plant gDNA Kit 購于Promage公司。PCR引物合成和測序由北京睿博興科生物技術有限公司和南京金斯瑞技術有限公司完成。其他常規試劑購自上海生工生物工程公司。

1.1.5 主要儀器 臺式高速冷凍離心機、PCR擴增儀（Applied Biosystems公司2720 thermal cycler儀器）、微量移液器（Eppendorf公司）、電泳儀、水平電泳槽、紫外反射投射儀、凝膠成像系統G：BOX F3（Syngene公司）、低溫冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取病原菌總DNA 收集菌絲，按照植物總DNA提取試劑盒的使用說明來提取菌株總DNA，置于-20℃保存備用。

1.2.2 SSR標記擴增病原菌 使用8對微衛星標記（SSR標記）［21-22］擴增病原菌總DNA，擴增體系（25 μL）：12.5 μL反應混合液2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye），正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，無菌水9.5 μL。SSR標記的正向引物5′端用不同的熒光FAM、ROX、TAMRA標記（北京睿博興科生物技術有限公司合成）。PCR程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃終延伸5 min。PCR產物由北京睿博興科生物技術有限公司完成測序。

根據每對SSR引物擴增PCR 產物大小，使用GeneMaker軟件（SoftGenetics，Pennsylvania State University，America）進行等位基因分配。相同引物擴增相同大小條帶被作為1個等位基因。每個菌株多位點單倍型結合8對SSR位點等位基因一起組成。如果不同菌株間多位點單倍型都一致則認為是同一個無性系中的個體，即無性生殖的后代。

1.2.3 交配型基因MAT1特異性引物擴增病原菌 交配型特異性引物依據GenBank下載A. alternata交配型全序列GU735423.1 和GU735413.1設計（表1）。 引物A擴增攜帶MAT1-1交配型異型體的病原菌，條帶大小為661 bp；引物B 擴增攜帶MAT1-2交配型異型體的病原菌，條帶大小為494 bp。將兩種引物混合進行PCR擴增即雙重PCR。擴增體系（20 μL）：10×PCR 反應緩沖液2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）1 μL，A正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，B正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL和無菌水9 μL。PCR程序：95℃預變性5 min；94℃變性60 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，33個循環；72℃終延伸10 min。用含有G8140 Golden ViewⅠ（北京Solarbio 科技有限公司）的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，100 V電泳1 h。在凝膠成像系統觀察結果并記錄。

表1 擴增鏈格孢屬真菌A. alternata交配型異型體的特異性引物序列信息

1.2.4 致病力試驗 菌株按照采樣地點分成7個群體（黑龍江、內蒙古、山東、河南、湖北、福建和云南群體）。每個群體挑選出約30種不同基因型A. alternata菌株置于PDA培養基，25℃條件下培養5 d。采用離體葉片法：摘取生長周期4 周大小的Favorita品種健康葉片，用無菌水沖洗表面后晾干，置于1%的水瓊脂 （瓊脂粉10 g/L）培養基中保濕培養。在試供菌株的菌落邊緣打直徑為5 mm的菌餅，接在健康的馬鈴薯葉片背面（生長4周大小Favorita品種葉片），每片葉子接1個菌餅，每株菌重復4次，對照接沒有菌的菌餅，置于22℃條件下16 h光照，8 h黑暗保濕培養。每天拍照記錄發病情況，用Assess軟件［23］測量第5天的病斑面積。

2 結果與分析

2.1 不同交配型病原菌致病力分布

根據SSR數據，從7個群體選出234株不同基因型的株菌，進行交配型和致病力鑒定。在這些菌株中，119株為MAT1-1，115株為MAT1-2，兩者的比例為1.03∶1，卡方檢測符合1∶1分布（χ2=0.04，df =1，P=0.84）。不同交配型菌株致病力分布趨勢相似（圖1）。病斑面積在0.5～2 cm2范圍內，MAT1-1交配型菌株數量大于MAT1-2交配型菌株數量，所占比例為75%、67%；病斑面積在3～5 cm2范圍以及7～11 cm2范圍內，MAT1-2交配型菌株數量大于MAT1-1交配型菌株數量，所占比例分別為13%與8%、5%與2% （圖1）。234株菌中不同交配型之間的病原菌致病力顯著不同，其中MAT1-1交配型菌株的病斑面積為0～9.31 cm2，平均病斑面積是1.72 cm2；MAT1-2交配型菌株的病斑面積為0～10.09 cm2，平均病斑面積是1.96 cm2。

圖1 不同交配型A. alternata致病力差異頻率分布

2.2 不同交配型病原菌致病力差異分析

表2 不同交配型和群體的A. alternata菌株致病力差異分析

方差分析結果表明不同群體、不同交配型的A. alternata在致病力上存在顯著差異（表2～表4）。由表3可知，在被分析的7個群體中，來自南方的群體比來自北方的群體致病力強，福建的群體致病力最強，山東的群體致病力最弱，兩者之間相差約1倍（2.32/1.17）。7個群體中除了河南和黑龍江群體外，MAT1-2交配型菌株致病力均顯著高于MAT1-1交配型菌株。7個群體中MAT1-2菌株致病力最強的是福建群體，最弱的是黑龍江群體；MAT1-1菌株致病力最強的是云南群體，最弱的是山東群體。總體來說，MAT1-2菌株的平均致病力為1.88，MAT1-1菌株的平均致病力為1.63，前者高于后者15.34%（表4）。

表3 最小顯著性差異法（LSD）比較7個A. alternata群體致病力差異

注：同列數據后大寫英文字母不同者表示差異極顯著，表4同。

表4 最小顯著性差異法（LSD）比較7個A. alternata群體內不同交配型菌株致病力差異

3 討論

本研究采用群體遺傳學的方法研究來自全國7個省份的A. alternata不同群體不同交配型的菌株致病力差異性。方差分析表明，導致菌株間致病力差異的原因由多因素決定，如菌株生長環境、交配型和菌株遺傳背景等，進而說明病原菌能否成功侵染寄主不僅與攜帶的毒性基因有關［24-25］，還與基因組中微效多基因有關［10，26］，這些基因對菌株致病力有加性遺傳效應［27］。

7個群體中南北方群體的菌株致病力有顯著差異，其中來自南方的福建群體比來自北方的山東群體致病力高98.29%，5/7群體中不同交配型菌株致病力有顯著差異。兩種不同的交配型致病力最強的群體分別是福建和云南，均屬于南方群體，平均而言7個群體中MAT1-2交配型菌株致病力比MAT1-1交配型菌株的高15.34%。同時在兩種交配型菌株致病力差異頻率分布圖中當病斑面積＜ 3 cm2時MAT1-1交配型菌株數量大于MAT1-2交配型菌株；當病斑面積＞ 3 cm2時，MAT1-2交配型菌株數量大于MAT1-1交配型菌株。MAT1-2交配型菌株的病斑面比MAT1-1交配型菌株的大13.95%。

自然條件下在25～28℃、相對濕度70% 以上的環境里容易發生馬鈴薯早疫病病害［28］。本研究的7個群體中福建省地理環境（緯度最低、熱帶季風氣候）更適合早疫病的發生，病原菌致病力相對較高。同時7個群體中MAT1-2菌株致病力最強的是福建群體，MAT1-1菌株致病力最強的是云南群體。總體來說，MAT1-2交配型菌株致病力比MAT1-1交配型菌株的強。 然而之前的研究發現，在全國A. alternata 兩種不同交配型菌株空間分布頻率呈1∶1等比例分布特點，高致病力的交配型菌株并沒有影響交配型菌株的頻率，這可能是由于其他生態特征與交配型的頻率依賴選擇導致［10］。對于有性和無性生殖交替循環的真菌來說，群體中暫時會出現更多致病力高的交配型菌株，但不同交配型菌株的分布頻率很快恢復到等比例分布的情況［29］。雖然與病原菌A. alternata致病力相關的生物因素和遺傳機制尚不清楚，試驗結果表明在馬鈴薯葉片上A. alternata侵染、傳播過程中MAT1交配型基因有一定作用。

參考文獻：

［1］ Anderson J B，Kohn L M，Leslie J F. Genetic mechanisms in fungal adaptation［A］. The fungal community：its organization and role in the ecosystem ［M］. New York：Marcel Dekker，1992：73-98.

［2］ Barrett L G，Thrall P H，Burdon J J，et al. Life history determines genetic structure and evolutionary potential of host-parasite interactions［J］. Trends in Ecol Evol，2008，23（12）：678-685.

［3］ Lengeler K B，Fox D S，Fraser J A，et al. Matingtype locus of Cryptococcus neoformans：a step in the evolution of sex chromosomes［J］. Eukaryotic Cell，2002（5）：704-718.

［4］ Li W，Metin B，White T C，et al. Organization and evolutionary trajectory of the mating type （MAT）locus in dermatophyte and dimorphic fungal pathogens ［J］. Eukaryotic Cell，2010，9（1）：46-58.

［5］ Arie T，Kaneko I，Yoshida T，et al. Mating-type genes from asexual phytopathogenic ascomycetes Fusariumoxysporum and Alternaria alternata［J］. Mol Plant Microbe Interact，2000，13（12）：1330-1339.

［6］ Stewart J E，Kawabe M，Abdo Z，et al. Contrasting codon usage patterns and purifying selection at the mating locus in putatively asexual Alternaria fungal species［J］. PLoS One，2011，6（5）：e20083.

［7］ Fraser J A，Diezmann S，Subaran R L，et al. Convergent evolution of chromosomal sex-determining regions in the animal and fungal kingdoms［J］. PLoS Biol，2004，2（12）：e384.

［8］ Lockhart S R，Wu W，Radke J B，et al. Increased virulence and competitive advantage of a/α over a/a or α/α offspring conserves the mating system of Candida albicans［J］. Genetics，2005，169（4）：1883-1890.

［9］ Barbour L，Xiao W. Mating type regulation of cellular tolerance to DNA damage is specific to the DNA postreplication repair and mutagenesis pathway［J］. Mol Microbiol，2006，59（2）：637-650.

［10］ Zhan J，Torriani S F，Mcdonald B A. Significant difference in pathogenicity between MAT1-1 and MAT1-2 isolates in the wheat pathogen Mycosphaerella graminicola［J］. Fungal Genet Biol，2007，44（5）：339-346.

［11］ Alvarez-Perez S，Blanco J L，Alba P，et al. Mating type and invasiveness are significantly associated in Aspergillus fumigatus［J］. Med Mycol，2010，48（2）：273-277.

［12］ Barchiesi F，Cogliati M，Esposto M，et al. Comparative analysis of pathogenicity of Cryptococcus neoformans serotypes A，D and AD in murine cryptococcosis［J］. J Infection，2005，51（1）：10-16.

［13］ Hausladen H，B?ssler E，Asensio N. Early blight of potato［J］. PPO-Special Report，2004（10）：173.

［14］ Mmbaga M T，Kim M S. Identification of Alternaria alternata as a causal agent for leaf blight in Syringa species［J］. Plant Pathol J，2011，27（2）：120-127.

［15］ 范子耀，王文橋，孟潤杰，等. 馬鈴薯早疫病病原菌鑒定及其對不同藥劑的敏感性［J］. 植物病理學報，2013，43（1）：69-74.

［16］ Zheng H，Zhao J，Wang T，et al. Characterization of Alternaria species associated with potato foliar diseases in China［J］. Plant Pathol，2014，64（2）：425-433.

［17］ 蒙靜雯. 中國馬鈴薯早疫病病原菌的群體遺傳結構［D］. 福州：福建農林大學，2015.

［18］ Stewart J E，Thomas K A，Lawrence C B，et al. Signatures of recombination in clonal lineages of the citrus brown spot pathogen，Alternaria alternata sensu lato［J］. Phytopathology ，2013，103（7）：741-749.

［19］ Stewart J E，Timmer L W，Lawrence C B，et al. Discord between morphological and phylogenetic species boundaries： incomplete lineage sorting and recombination results in fuzzy species boundaries in an asexual fungal pathogen［J］. BMC Evol Biol，2014，14 （1）：38.

［20］ 何凱，楊水英，黃振霖，等. 馬鈴薯早疫病菌的分離鑒定和生物學特性研究［J］. 中國蔬菜，2012（12）：72-77.

［21］ Benichou S，Dongo A，Henni D E，et al. Isolation and characterization of microsatellite markers from the phytopathogenic fungus Alternaria dauci［J］. Mol Ecol Resour，2009，9（1）：390-392.

［22］ Meng J，Zhu W，He M，et al. High genotype diversity and lack of isolation by distance in the Alternaria solani populations from China［J］. Plant Pathol，2015，64（2）：434-441.

［23］ Lamari L. Assess：image analysis software for plant disease quantification［M］. American：Phytopatological Society，2002.

［24］ 耿銳梅，曹長代，董世峰，等. 植物寄主與病原真菌互作研究進展［J］. 中國果菜，2011（4）：23-26.

［25］ Zhan J，Thrall P H，Burdon J J. Achieving sustainable plant disease management through evolutionary principles［J］. Trends Plant Sci，2014，19（9）：570-575.

［26］ Makhdoomi A，Mehrabi R，Khodarahmi M，et al. Efficacy of wheat genotypes and Stb resistance genes against Iranian isolates of Zymoseptoria tritici［J］. J Gen Plant Pathol，2015，81（1）：5-14.

［27］ Zhan J，Mcdonald B A. Experimental measures of pathogen competition and relative fitness［J］. Annu Rev Phytopathol，2013，51：131-153.

［28］ 臺蓮梅，鄭寰宇，左豫虎，等. 黑龍江省馬鈴薯早疫病菌生物學特性研究［J］. 植物保護，2012，38 （1）：85-89.

［29］ Sommerhalder R J，Mcdonald B A，Zhan J. The frequencies and spatial Distribution of mating types in Stagonospora nodorum are consistent with recurring sexual reproduction［J］. Phytopathology，2006，96 （3）：234-9.

（責任編輯 崔建勛）

Significant difference in pathogenicity of MAT1-1 and MAT1-2 isolates in potato pathogen Alternaria alternata

MENG Jing-wen1，2，XIE Ye-kun1，SHEN Lin-lin1，LI Dong-liang1，ZHU Wen1，ZHAN Jia-sui1
（1. Institute of Plant Virology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2. Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

Abstract：Alternaria alternata collected from seven provinces （Heilongjiang，Inner Mongolia，Shandong，Henan，Hubei，Fujian and Yunnan）in China were molecularly characterized using neutral SSR markers and mating typespecific primers. Among them，234 distinct genotypes were selected for pathogenicity analysis by detached leaf assay. The result indicated that，on average，the pathogen from South displayed higher pathogenicity than that from North. For example，the pathogenicity of pathogen from Fujian was 98.29% higher than that from Shandong. The result also showed a significant difference in pathogenicity between MAT1-1 and MAT1-2 isolates. On average，MAT1-2 isolate displayed 15.34% higher pathogenicity than MAT1-1 isolate.

Key words：Alternaria alternata；potato early blight；pathogenicity；mating types；detached leaf inoculation

中圖分類號：S432.1

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）02-0089-05

收稿日期：2015-10-13

基金項目：國家現代農業（馬鈴薯）產業技術體系（CARS-10）

作者簡介：蒙靜雯（1985-），女，在讀博士生，E-mail：mjw175860836@163.com

通訊作者：詹家綏（1963-），男，博士，教授，E-mail：jiasui.zhan@fafu.edu.cn