炎癥相關miRNAs在LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞炎性反應中的表達及miR-223真核表達載體的構建

郝俊芳，黃　凱，王月影，杜麗麗，鐘　凱*

(1.河南農業大學農業部動物生化與營養重點開放實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002)

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炎癥相關miRNAs在LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞炎性反應中的表達及miR-223真核表達載體的構建

郝俊芳1，2，黃凱2，王月影1，2，杜麗麗1，2，鐘凱1，2*

(1.河南農業大學農業部動物生化與營養重點開放實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002)

摘要：小分子RNA (miRNA)是近年來發現的一類內源性、非編碼單鏈小RNA，其在乳腺組織免疫防御過程中發揮的調控作用逐漸引起了人們的關注。作者擬用qRT-PCR檢測炎癥相關miRNAs在LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞炎癥反應中的表達變化；構建3種miR-223真核表達載體并檢驗重組載體的轉染效率。用不同濃度 LPS處理小鼠乳腺上皮細胞(EpH4-Ev)48 h，qRT-PCR檢測miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表達變化。以EpH4-Ev細胞基因組DNA為模板，PCR擴增pre-miR-223序列，以質粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和轉座子piggyBac為母本構建3種miR-223真核表達載體，將其轉染EpH4-Ev細胞，通過觀察熒光、qRT-PCR檢測miR-223的表達，評價重組質粒轉染效率。結果：qRT-PCR檢測結果表明，LPS誘導EpH4-Ev細胞炎癥反應時，4種炎癥相關miRNAs的表達均顯著 (P<0.05或P<0.01) 增加，并呈現不同程度的劑量依賴性；重組質粒轉染 EpH4-Ev細胞后，qRT-PCR檢測結果顯示，Mini-miR-223質粒轉染組的miR-223表達水平無統計學差異(P>0.05)；PB-miR-223和pcDNA-miR-223轉染EpH4-Ev細胞后，miR-223的表達均極顯著(P<0.001)增加。本研究表明炎癥相關miRNAs參與LPS誘導小鼠EpH4-Ev細胞的炎性反應過程。成功構建3種miR-223真核表達載體，為后續miRNAs在乳腺炎癥反應中的功能研究奠定基礎。

關鍵詞：炎癥相關miRNAs；乳腺上皮細胞；LPS；真核表達載體；乳腺炎

小分子RNA (microRNA，miRNA)是近年來發現的一類內源性的非編碼單鏈小RNA，其大小為20～25個堿基，通過直接結合到靶mRNA分子的3′非翻譯區(3′ untranslated regions，UTRs)，在轉錄后水平對靶mRNAs進行降解或翻譯抑制來參與基因表達的調控[1-2]。研究表明miRNA參與眾多生理疾病過程的調控，包括炎癥反應[3]。奶牛乳房炎(bovine mastitis)是迄今為止世界范圍內仍未得到有效解決的頑疾，嚴重影響養殖業和乳業的發展[4]。miRNAs在奶牛乳房炎癥反應過程中的調控作用已逐漸引起了研究者的關注。

2014年，多位研究者[5-7]利用下一代測序技術(next generation sequencing，NGS)對病原菌入侵乳腺組織時，動物機體miRNA表達譜的變化進行了研究。研究結果表明，在病原菌引起乳腺組織炎癥反應時，miRNAs的表達均發生了顯著變化。F.Dilda等[8]對LPS和S.aureus內毒素B誘導的牛單核細胞中5種炎癥相關miRNA(inflammation related miRNAs)——miR-9、miR-125b、miR-155、miR-146a、miR-223的表達變化進行了研究。A.Naeem等[9]利用qRT-PCR對乳房鏈球菌感染的奶牛乳腺組織中幾種miRNAs(miR-16、miR-146a/b、miR-155、miR-181a、miR-223)的表達進行了研究，并用生物信息學方法預測和分析了miRNA的靶基因。上述研究結果均表明，一些miRNAs在乳腺炎癥反應過程中發揮了重要的調控作用[10]，但更加深入的研究還未見報道。

由革蘭陰性菌——大腸桿菌引起的奶牛乳房炎較為常見[11]，而脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌的主要致病因子[12]，其誘發的炎癥反應和革蘭陰性菌感染引起的炎癥變化相似。乳腺上皮細胞是研究乳腺功能的重要體外模型，是病原菌穿越乳導管進入乳腺后首先接觸的細胞，因此充當了防御乳腺感染的第一道防線。研究發現乳腺上皮細胞除了合成乳中的主要營養成分外，能產生多種免疫活性因子，例如細胞因子、趨化因子和宿主防御肽等[13-15]，因此其在乳腺感染的過程中發揮著免疫防御的功能。

本研究以不同濃度的LPS誘導小鼠乳腺上皮細胞(EpH4-Ev)發生炎癥反應，qRT-PCR檢測幾種炎癥相關miRNAs的表達變化，驗證炎癥相關miRNAs是否參與乳腺上皮細胞免疫防御反應的調控；構建包含miR-223前體序列的3個類型真核表達載體，對比其過表達的效率，篩選出理想的miRNA真核過表達載體，為進一步深入研究miRNAs在乳腺炎癥發生和發展中的作用提供有力工具。

1材料與方法

1.1試驗材料

小鼠乳腺上皮細胞系EpH4-Ev (ATCC，美國)； LPS(Sigma-Aldrich，美國)；SYBR?PrimeScript miRNA RT-PCR Kit (寶生物，大連)；限制性內切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶和DL2000、15000 marker(NEB，美國)；膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒及PCR純化試劑盒(上海生工)；Plasmid Midi Kit (25) (QIAGENE，德國)； Minicircle DNA 和piggyBac Transposon 質粒載體(SBI，美國)；pcDNA3.1(+)質粒和LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國)；嘌呤霉素(puromycin，Sigma，美國)；細胞熒光成像分析儀(Smart fluorescent Cell analyzer Digital Bio，韓國)；E.coliTop10和ZYCY10P3S2T感受態細胞為本實驗室保存。

1.2細胞培養

EpH4-Ev細胞培養于含10%的胎牛血清、4.0 mmol·L-1L-谷氨酰胺、4 500 mg·L-1葡糖糖、不含丙酮酸鈉的HyClone完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，貼壁后，體積明顯增大，待細胞密度達95%時，呈鋪路石樣生長。

1.3細胞處理及分組

按1×106·孔-1將EpH4-Ev細胞，接種于六孔板，過夜培養，待細胞融合度達80%～90%時，以1、5、10 μg·mL-13個水平的LPS處理EpH4-Ev細胞，未經處理的EpH4-Ev細胞作為對照組，每組設3個復孔，48 h后收集細胞。

1.4總RNA提取及qRT-PCR檢測炎癥相關miRNAs的表達變化

利用1 mL的RNAiso Plus裂解細胞，提取總RNA。miRNAs反轉錄采用poly(A)加尾法，按照TaKaRa公司試劑盒說明書將其反轉錄為cDNA。qRT-PCR反應體系：5 μL 2xSYBR Premix Ex TaqⅡ；上下游引物各 0.1 μL(20 μmol·L-1)；1.25 μL cDNA，DEPC水補齊10 μL，反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環，U6作為內參檢測miRNA的表達水平，所有操作均在冰上完成。qRT-PCR的下游引物是miRNA通用引物，上游引物，見表1。

表1miRNAs定量PCR引物序列

Table 1Primer sequence of miRNAs used for qRT-PCR

1.5pre-miR-223引物設計與合成

根據miRBase數據庫中預測的小鼠miR-223前體序列，插入序列不僅包含pre-miR-223，而且，同時向其上下游兩端的側翼幅跨100～200 bp序列，以保證高水平的表達pre-miR-223，擴增產物長度約為432 bp。引物序列如下：上游5′-tctagaGCCACCCACCCAGGATCCCCGTTTTT-3′(劃線部分依次為XbaⅠ酶切位點、Kozak序列)，下游5′-gaattcTGTAGACCCCAGAGCTGCAT-3′(劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)。

1.6miR-223真核表達載體的構建與鑒定

以小鼠EpH4-Ev細胞基因組DNA為模板，擴增目的基因，將帶有酶切位點的miR-223片段和3個質粒分別用XbaⅠ、EcoRⅠ雙酶切，并用 T4 DNA連接酶連接。重組質粒轉化E.coliTop10，Minicircle質粒用卡那霉素篩選，piggyBac和pcDNA3.1(+)質粒用氨芐霉素篩選。挑單克隆菌落，做菌液PCR，電泳鑒定的陽性菌送上海生工測序。測序結果和pre-miR-223的序列用BiXM2.6軟件進行序列比對分析。構建成功的miR-223表達質粒命名為Mini-miR-223、PB-miR-223和pcDNA-miR-223。

1.7重組質粒轉染EpH4-Ev細胞

106·孔-1的EpH4-EV細胞接種于六孔板，細胞融合度需達80%，在轉染前2 h更換成無血清物無雙抗的DMEM?？蛰d質粒為陰性對照組，重組質粒為試驗組，每組設3個復孔。轉染試劑用LipofectamineTM2000，具體操作步驟如下：用100 μL·孔-1預冷的無血清無雙抗的培養液分別進行稀釋2 μg DNA和5 μL的LipofectamineTM2000，室溫靜置5 min后，將兩者混合，室溫靜置20 min，緩慢均勻滴入孔內，6 h更換培養液。PB-miR-223質粒需按1∶0.8的比例添加PBase酶。轉染24 h后將各組細胞在Smart fluorescent Cell analyzer儀上觀察miRNAs重組質粒的GFP表達[pcDNA3.1(+)表達載體不含綠色熒光蛋白基因]，并采集圖像。同時，用12孔板測定嘌呤霉素對EpH4-Ev細胞的篩選濃度為8 μg·mL-1，轉染PB-miR-223質粒的EpH4-Ev細胞經篩選12 d，傳代3～4次，形成穩定過表達miR-223基因細胞系。反轉錄如前所述，qRT-PCR檢測成熟miR-223表達。

1.8數據處理

2結果

2.1LPS誘導EpH4-Ev細胞炎癥反應時炎性相關miRNAs的表達變化

與對照組相比，LPS刺激后EpH4-Ev細胞的4種炎癥相關miRNAs的表達均呈現增加趨勢(圖1)。5 μg·mL-1LPS處理組的4種炎癥miRNAs的表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而10 μg·mL-1LPS處理組的4種miRNAs的表達極顯著升高(P<0.01)，結果表明，4種炎癥相關miRNAs在LPS刺激后表達均顯著增加，并呈現明顯的劑量依賴性。

2.2pre-miR-223基因的PCR擴增

以EpH4-Ev細胞基因組DNA為模板，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段大小約為432 bp，與預期大小相符(圖2)。

2.3單酶切鑒定誘導的Mini-miR-223微環

用EcoRⅠ單酶切誘導前的MP-miR-223質粒和誘導后Mini-miR-223質粒，電泳結果顯示：在7 487 bp和 3 432 bp左右各有1條特異性條帶(圖3)，與預期值一致，證實微環DNA誘導成功。

2.4Mini-miR-223、PB-miR-223轉染EpH4-Ev細胞后EGFP的表達

EpH4-Ev細胞中Mini-miR-223質粒瞬時表達和PB-miR-223質粒的穩定表達見圖4。

2.5qRT-PCR檢測3種真核表達載體轉染EpH4-Ev細胞后miR-223的表達

如圖5所示，與對照組相比，Mini-miR-223、質粒轉染EpH4-Ev細胞后，miR-223的表達無顯著變化(P>0.05)；轉染PB-miR-223質粒的細胞，經8 μg·mL-1Puro篩選形成的穩定細胞系可以有效過表達miR-223，與對照組相比，miR-223的表達極顯著增加(P<0.001)；pcDNA-miR-223質粒轉染細胞后，miR-223的表達極顯著增加(P<0.001)。以上結果表明PB-miR-223和pcDNA-miR-223重組質粒能夠在EpH4-Ev細胞中高效特異性的過表達成熟的miR-223。

3討論

奶牛乳房炎一直是困擾奶牛養殖業的常見病和多發病，人們對其發病機制已進行了多年的研究仍未有大的突破，因此，研究者需要尋找參與乳房炎病理過程中新的靶分子及其適當的調控途徑。MicroRNAs作為一類新的基因表達調控分子參與機體穩態調節，其參與了眾多疾病的病理過程，可作為疾病診斷標志物或干預治療的靶標。miRNAs在奶牛乳房炎發生發展中作用的研究尚處于起步階段，仍有許多未知領域需要更加深入的研究。前人的許多研究多關注于miRNAs在免疫細胞炎癥反應中所發揮的作用，而本研究以乳腺上皮細胞為研究對象，利用qRT-PCR檢測幾種炎癥相關miRNAs在LPS人工誘導的炎癥反應中的表達變化。

前人的研究已證明miR-223在粒細胞的增殖與分化過程中發揮了重要作用。L.M.Li等[17]研究發現，與健康的對照組乳腺組織相比，S.aureus感染的乳腺組織中miR-223的表達上調了1.95倍(P<0.05)，該研究還證實高遷移率族蛋白1(high-mobility group box protein 1，HMGB1)是miR-223的靶基因之一，HMGB1的3′-UTR的單核苷酸多態性(SNP)與奶牛乳房炎的易感性有關。A.Naeem等[9]研究發現，用鏈球菌感染動物健康乳腺組織后，miR-223明顯上調2.5倍。本研究結果表明，不同濃度LPS刺激EpH4-Ev細胞48 h 后，miR-223的表達呈劑量依賴性增高。這表明，大腸桿菌(LPS)導致的乳腺炎癥反應與S.aureus、S.ubiris引發的乳房炎一樣，miR-223的表達顯著升高。這也與其他研究[18-19]的結果相似。miR-181a主要表達于B淋巴細胞，在乳腺癌[20]、胃癌[21]高表達，發揮著類似抑癌基因的功能，這個研究結果進一步證實miR-181a對早期乳腺炎癥反應的調控作用。miR-146a[22-23]作為與炎癥反應密切相關的重要分子，也是研究其功能最多的miRNA之一。K.D.Taganov等[22]用 LPS刺激THP-1細胞，發現miR-146a表達較對照組顯著增高，其通過靶基因的翻譯抑制，參與炎癥反應。miR-155 參與多種炎癥過程，人單核細胞受LPS刺激后，miR-155的表達增高[22]，同樣，正常人纖維細胞的炎癥介質可以誘導miR-155的表達升高[24]。該試驗結果與上述miRNA在LPS等誘導的乳腺組織炎癥反應中上調表達的趨勢一致。

目前miR-223在奶牛乳房炎癥作用及其機制仍缺乏報道，構建能夠過表達miR-223的真核載體，是研究其對靶基因的調控作用和進行miRNA作用機制研究的基礎。因此，本研究構建3個miR-223真核表達載體，對比其過表達miR-223的效率。Mini-miR-223微環的成功誘導是采用傳統的L-阿拉伯糖介導的重組酶表達，得到一種含目的基因表達的微環 DNA[25-27]。Mini-miR-223質粒過表達效率低，原因之一，可能是由于其不含真核篩選基因，細胞在整合外源基因的過程中未加壓傳代[28]，使目的蛋白表達不斷降低。當然不同細胞系本身的性質決定了轉染效率。相比之下，piggyBac真核表達載體不僅含有哺乳動物的強啟動子CMV，而且在EGFP間接反映重組質粒表達的同時，puro的真核篩選基因有助于篩選到穩定高效表達miR-223的EpH4-Ev細胞系。本試驗PcDNA-miR-223質粒在EpH4-Ev細胞中的產物也具有生物活性。

本研究成功構建miRNA的真核表達載體，為進一步研究miRNA在奶牛乳房炎癥發生發展過程中的調控機制奠定了基礎。

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(編輯白永平)

Expression of Inflammation-related miRNAs in the LPS-induced Inflammation in Murine Mammary Epithelial Cells and Construction of miR-223 Eukaryotic Expression Vector

HAO Jun-fang1，2，HUANG Kai2，WANG Yue-ying1，2，DU Li-li1，2，ZHONG Kai1，2*

(1.KeyLabofRegulationonAnimalGrowthandDevelopmentofAgriculturalMinistryofChina，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

Key words:inflammation-related miRNAs；mammary epithelial cells；LPS；eukaryotic expression vector；mammary inflammation

Abstract:Small RNA (miRNA) is a class of endogenous，single strand，small non-coding RNAs，which is recently discovered.Its regulation in the process of immune defense in mammary tissue gradually attracted people’s attention.Expression changes of inflammation-related miRNAs have been detected in mouse mammary epithelial cells when inflammation reaction induced with LPS occurred with qRT-PCR；we have also constructed 3 kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors and tested recombinant vectors transfection efficiency.Mouse mammary epithelial cells (EpH4-Ev cells) have been incubated with different dose of LPS for 48 h，then，expressions of miR-223，miR-146a，miR-181a and miR-155 have been detected with qRT-PCR.Genomic DNA of EpH4-Ev cells were used as a template and pre-miR-223 cDNA sequence was amplificated with PCR.PCR product was combined with Minicircle，pcDNA3.1(+) and piggyBac transposon，separately，to construct three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors.Three kinds of recombined vectors were transfected into EpH4-Ev cells，respectively.Expression of miR-223 was measured and green fluorescence was observed in order to evaluate transfection efficiency of recombinant plasmid.qRT-PCR results showed that expression of 4 kinds of inflammation-related in EpH4-Ev cells significantly increased when inflammation induced by LPS (P<0.05 orP<0.01)，and the expression change was in a dose-dependent manner.qRT-PCR results showed that the expression level of miR-223 had no significant change (P>0.05) when Mini-miR-223 plasmid transfected into the EpH4-Ev cells，while the expression of miR-223 significantly increased when PB-miR-223 and pcDNA-miR-223 transfected EpH4-Ev cells (P<0.001).Inflammation-related miRNAs have been showed involved in the process of inflammation induced by LPS in mouse EpH4-Ev cells.Three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors have been constructed successfully，and may contribute to further research of the modulation significance of miRNAs in the mammary gland immune reaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.025

收稿日期：2015-05-23

基金項目：國家自然科學基金(31470120)

作者簡介：郝俊芳(1989-)，女，河南林州人，碩士生，主要從事泌乳生物化學研究，E-mail：haojunfang163@163.com *通信作者：鐘凱(1974-)，女，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事泌乳生物化學研究，E-mail：zhongkai@henau.edu.cn

中圖分類號：S857.26

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0183-07