奶牛產后血漿1H-NMR代謝組學分析

陶金忠，郭延生

(寧夏大學農學院動物科學系，銀川 750021)

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奶牛產后血漿1H-NMR代謝組學分析

陶金忠*，郭延生

(寧夏大學農學院動物科學系，銀川 750021)

摘要：為了從代謝組角度系統揭示奶牛分娩后能量缺乏的生理機制，采用1H-NMR 代謝組學技術，結合多元統計學方法探討了奶牛分娩后不同階段血漿小分子代謝物的變化趨勢及其對能量代謝通路的影響。結果表明：奶牛分娩后第7天與分娩第1天之間血漿代謝輪廓無明顯差異；分娩后第14天與第1天之間血漿代謝輪廓出現明顯差異，其差異標志物為不飽和脂肪酸、膽堿和氧化三甲胺；分娩后第28天與第1天之間血漿代謝輪廓也存在明顯差異，其差異標志物為不飽和脂肪酸、膽堿、氧化三甲胺、三羧酸和葡萄糖；隨著分娩后時間的延長，不飽和脂肪酸、膽堿和三羧酸表達逐漸上調，而氧化三甲胺和葡萄糖表達逐漸下調。可見，隨著奶牛分娩后泌乳量的不斷增加，逐漸呈現出能量負平衡狀態，而機體應答性的上調了脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑以緩解奶牛分娩后的能量負平衡狀態。研究結果可為進一步闡明奶牛分娩后能量負平衡的生理機制提供科學依據。

關鍵詞：奶牛；圍產期；能量負平衡；代謝組學；1H核磁共振

圍產期是奶牛整個泌乳周期中最至關重要的一個時期，在這個階段，奶牛經歷了巨大的代謝變化，主要表現在干物質攝入減少而能量需求增加所致的能量負平衡(NEB)[1]。大多數研究表明，圍產期奶牛能量代謝特點是干物質攝入減少及能量負平衡，在正常生理情況下，母牛分娩后的4～6周出現泌乳高峰，但其食欲恢復和采食量的高峰約在產犢后8～10周。因此，在產犢后10周內奶牛攝入的能量不能滿足泌乳消耗的需要，如果奶牛泌乳量過高，將勢必加劇這種不平衡，繼而引發酮病、脂肪肝等圍產期能量代謝障礙性疾病[2]，給奶牛業帶來嚴重的經濟損失。目前，對于奶牛產后NEB的發生規律的研究，已經從最初的生理和生化水平，發展到現在的分子水平，但其精確的發生機制仍未完全清楚。

代謝組學技術已經逐漸成為探索代謝物質新陳代謝過程的重要技術平臺，該技術可全面地展示機體內所有代謝物在生理或病理狀態下的代謝變化，以及研究細胞代謝過程中最接近末端的代謝物，因此應用代謝組學的理論和技術將有助于全面揭示奶牛產后NEB的發生機制、細胞代謝過程、系統功能聯系網絡，對進一步豐富和發展奶牛產后NEB理論具有非常重要的科學意義。近年來已建立的代謝組學技術平臺有高分辨核磁共振(NMR)、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)等[3]。NMR 技術是最早用于代謝組學的分析方法，具有分辨率高、不破壞樣品結構和性質且能對樣品實現非選擇性分析等優點[4]。本試驗采用1H-NMR代謝組學技術分析奶牛分娩后血漿代謝物的變化，尋找奶牛分娩后不同階段的差異代謝物，以期從代謝組角度闡明奶牛分娩后能量缺乏的機制，為進一步緩解能量負平衡和預防奶牛酮病與脂肪肝等圍產期能量代謝障礙性疾病的發生提供理論依據。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

德國Bruker AVIII 600 MHz NMR 譜儀(配備超低溫探頭)，美國BECKMAN 公司OPTIME L-80 低溫高速離心機，DW-86L628海爾超低溫冰箱。100 mL 45 mmol·L-1Na+/K+緩沖液(K2HPO4·3H2O 0.830 g，NaH2PO4·2H2O 0.139 g，D2O：100 mL，NaCl 0.9 g)。

1.2動物和樣品采集

試驗奶牛來自寧夏某規模化養殖廠，選擇9頭2～3胎的荷斯坦分娩奶牛，分別在產后第1、7、14和28天尾靜脈采血，3 000 r·min-1，4 ℃離心10 min制備血漿，于-80 ℃冰箱保存。血漿樣品和核磁編號見表1。

表1產后奶牛血漿樣品和核磁編號

Table 1Codes of plasma samples and1H-NMR form postpartum cows

1.3血漿樣品的1H-NMR分析

所有血漿樣品的一維1H-NMR譜的采集在配備有超低溫探頭的Bruker AVIII 600 MHz NMR 譜儀(Bruker Biospin，德國)上完成，質子共振頻率為600.13 MHz，實驗溫度為298 K。每個血樣精確吸取180 μL樣品和360 μL Na+/K+緩沖液(45 mmol·L-1)，4 ℃條件下離心10 min(12 000 r·min-1)，抽取上清液500 μL至5 mm核磁管[5]，混勻后進行核磁檢測，記錄所有檢測樣品的1H-NMR譜。

1.41H-NMR數據采集和數據預處理

使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)序列[RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ]采集小分子信息。參數設置如下：譜寬(SW)為20 ppm，等待時間(RD)為2 s，90°脈寬為11.5 μs，采樣點數為32 K，自由感應衰減(FID)累計信號采集次數為128次。回波演化時間(d20)為350 μs，回波循環(L4)為100，總回波時間(2nτ)為70 ms[6]。

1H-NMR 譜和基線校正均使用 TopSpin 軟件人工處理，用葡萄糖(δ 5.23)的信號進行化學位移定標，然后對核磁譜圖(δ 8.5 ～ 0.6)進行積分(積分區間大小為0.004 ppm)和化學位移校正。為了消除因樣品的濃度差異造成的分析誤差，對所得數據進行歸一化。目前常用的歸一化方法有總面積歸一化[7]、概率熵歸一化[8]、重量歸一化[9]、向量歸一化和不歸一化[7]等。不同歸一化方法各有其優缺點，適用的對象和條件不盡相同。其中概率熵歸一化(PQN)是在總面積歸一化的基礎上，通過計算譜圖中熵幅度的分布來尋找樣品的最佳熵值(即最佳稀釋因子)來還原樣品的真實濃度。當樣品中出現變化劇烈的信號時，概率熵歸一化的方法比較適用，有利于分析其他容易被忽略的代謝物的變化規律。對于本項目的血漿樣品，葡萄糖的濃度可能發生急劇變化，因此概率熵歸一化(PQN)是合適的選擇。

1.51H-NMR譜數據的統計學分析

將歸一化處理后的數據導入SIMCA-P+軟件包(V.11.0，Umetrics，Sweden)進行主成分分析(PCA)，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交化偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[10]。采用 PCA 的方法來評價組間樣本的總體分布狀況，觀察自然凝集狀態和確定是否存在奇異樣本；用 PLS-DA 和 OPLS-DA 鑒別區分各組間代謝物貢獻值，找到最相關的差異代謝物。對PLS-DA和OPLS-DA 模型使用7 層交叉驗證(7-fold cross validation)，其中PLS-DA 使用了排列實驗進行驗證(重復次數n= 200)，OPLS-DA使用交叉驗證殘差的方差分析(CV-ANOVA)進行驗證。

OPLS-DA結果用得分圖和相關系數負載圖來表示，相關系數負載圖是將每一個變量的loading值與其標準偏差進行數據的回溯轉換，最后導入基于MATLAB的多變量分析負載作圖軟件系統中作圖。該圖用顏色對代謝物相關系數的絕對值進行編碼，紅色表示該代謝物對組間的區分具有顯著貢獻，而藍色表示該代謝物對組間的區分無顯著性的貢獻。此外，通過皮爾森相關系數顯著性差異檢測(Pearson’s Product-moment correlation coefficient)，并綜合考慮組內樣本數N，確定評估代謝物含量是否具有顯著性變化的閾值(P≤0.05)。由于樣本數N=9，相關系數的閾值為0.632，因此本試驗選擇相關系數絕對值|r| ≥ 0.632的代謝物作為顯著性差異代謝物。

1.6產后奶牛差異代謝物的代謝通路及變化趨勢

將鑒定后的生物標志物輸入KEGG數據庫(http：//www.kegg.com)，選擇Bos taurus (cow通路)為通路路徑庫，進行代謝通路的查詢，并將各差異代謝物的峰面積平均值作為相對含量，繪制奶牛產后各差異代謝物與產后天數曲線圖，分析各差異代謝物的變化趨勢。

2結果

2.1產后奶牛血液代謝物的1H-NMR建立與指認

通過對原始譜圖的分析，發現第2組24號樣品(核磁編號1 024)的水峰抑制效果(圖1中桔黃色譜圖)與其他樣品差別較大，其原因可能是由于自動進樣時勻場差異導致水峰壓制效果較差，因此作為異常點在后續分析中去除，建立奶牛血樣的代表性的1H 核磁譜圖(圖2)。根據每個代謝物的化學位移，裂峰情況及偶合常數，結合文獻[11-12]數據，并參照Chenomx NMR Suite(加拿大Chenomx Inc.公司)數據庫，對所得的圖譜(圖2)進行指認。

2.2代謝物的統計學分析

為了從代謝層面判斷奶牛產后機能的恢復情況，本試驗以產后第1天作為對照組，分別與產后第7天、第14天和第28天的核磁數據導入SIMCA-P+軟件包進行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析，并采用排列試驗(permutation test)和CV-ANOVA(variance analysis of the cross-validated residuals)[12]，分別對PLS-DA 和OPLS-DA模型的有效性進行檢驗，各組PCA、PLS-DA和OPLS-DA得分圖見圖3。

奶牛產后第1天與產后第7天PLS-DA模型R2X=0.352，Q2=0.222，Q2<0.4，表明模型預測能力較差，并且未通過排列實驗驗證，PLS-DA模型無效； OPLS-DA模型中R2X=0.352，Q2=0.452，雖然Q2>0.4，且CV-ANOVA檢驗中P=0.100(P<0.05模型才有效)，因此OPLS-DA模型也無效，后續分析中止，這表明奶牛產后1天與7天血液代謝物之間無顯著差異。

奶牛產后第1天與產后第14天PLS-DA模型R2X=0.251，Q2=0.431，Q2>0.4，表明具有較好的預測能力，但未通過排列實驗，OPLS-DA模型R2X=0.251，Q2=0.663，Q2>0.4，且CV-ANOVA驗證模型有效(P=0.05)，表明奶牛產后第1天與第14天之間血液代謝物存在明顯差異。

奶牛產后第1天與產后第28天PLS-DA模型R2X=0.579，Q2=0.844，Q2>0.4，但未通過排列實驗，OPLS-DA模型R2X=0.358，Q2=0.681，Q2>0.4，CV-ANOVA驗證模型有效(P=0.03)，表明奶牛產后第1天與第28天之間血液代謝物存在明顯差異。

2.3顯著性差異代謝物的歸屬

相關系數負載圖和顯著性差異代謝物歸屬分別見圖4、表2和表3，結果顯示，奶牛分娩后第1天與第14天顯著性差異代謝物為4種不飽和脂肪酸、膽

表2奶牛產后第1天與第14天顯著性差異代謝物歸屬表

Table 21H-NMR signal assignments of significant differential metabolites between 1stday and 14thday after delivery

峰的多重性：s.單峰； m.多重峰，b.廣泛共鳴峰；“↓”表示分娩后第14天相對于分娩后第1天含量下降；“↑”表示分娩后第14天相對于分娩后第1天含量增加

Multiplicity：s.Singlet；m.Multiplet；b.Broad peak；TMAO.Trimethylamine-N-oxide；Compared to 1stday after delivery，“↓” denote down regulated expression，and“↑”denote up-regulated expression at 14thday after delivery

表3奶牛產后第1天與第28天顯著性差異代謝物歸屬表

Table 31H-NMR signal assignments of significant differential metabolites between 1stday and 28thday after delivery

峰的多重性：s.單峰； d.雙峰；dd.二聯的雙重峰；m.多重峰，b.廣泛共鳴峰；“↓”表示分娩后28天相對于分娩后第1天含量下降；“↑”表示分娩后28天相對于分娩后第1天含量增加

Multiplicity：s.Singlet；d.Doublet；dd.Doublet of doublets；m.Multiplet；b.Broad peak；TMAO.Trimethylamine-N-oxide；Compared to 1stday after delivery，“↓” denote down regulated expression，and“↑”denote up-regulated expression at 28thday after delivery

堿和氧化三甲胺，其中4種不飽和脂肪酸和膽堿表達上調，氧化三甲胺表達下調；與分娩后第28天差異代謝物為4種不飽和脂肪酸、膽堿、氧化三甲胺、三羧酸和葡萄糖，其中4種不飽和脂肪酸、膽堿和三羧酸表達上調，氧化三甲胺和葡萄糖表達下調。

2.4產后奶牛差異代謝物變化趨勢

從表4和圖5可以看出，奶牛產后4種不飽和脂肪酸(UFAs1、UFAs2、UFAs3和UFAs4)、三羧酸、膽堿、氧化三甲胺和葡萄糖含量隨產后時間的延長發生了不同程度變化，其中4種不飽和脂肪酸(UFAs1、UFAs2、UFAs3和UFAs4)、三羧酸和膽堿呈逐漸升高趨勢，而氧化三甲胺和葡萄糖呈逐漸降低趨勢。從相關系數負載圖可知，4種不飽和脂肪酸、氧化三甲胺和葡萄糖在產后第14天已經出現了顯著性變化，至第28天，三羧酸和葡萄糖含量也相繼出現顯著性變化。

表4奶牛產后第1、7、14和28天差異代謝物相對含量

Table 4Relative content of differential metabolites at 1st，7th，14thand 28thday after delivery

3討論

血糖含量變化是機體對糖的吸收、運轉和代謝的動態平衡狀態的反映，循環血液中葡萄糖的濃度體現奶牛的能量代謝水平。奶牛產后葡萄糖主要用于合成乳糖，隨著產后泌乳量的持續增高，機體對葡萄糖的需要量也不斷增加，奶牛在這個階段容易發生能量負平衡[13]。奶牛分娩后4～6 周出現泌乳高峰，但其食欲恢復和采食量的高峰在8～10 周，食欲恢復遠遠落后于能量的需要，如果此階段泌乳量過高，將勢必加劇這種能量負平衡，血糖急劇下降。本試驗結果也顯示奶牛產后血糖呈下降趨勢，產后第28天血糖含量顯著低于產后第1天，這表明奶牛在產后4周左右出現泌乳高峰，從而加劇了能量的負平衡狀態。

血液中血糖濃度急劇下降，為了滿足泌乳頭幾周的能量需要，奶牛從脂肪組織中動員大量的脂肪酸，結果導致循環中游離脂肪酸濃度(NEFA)急劇升高，被動員的體脂通過血液進入其他組織，20%被乳腺利用，其余大部分被肝吸收[14]，本試驗結果也顯示奶牛產后第28天內不飽和游離脂肪酸濃度持續升高，且產后第14天后顯著升高，這說明奶牛產后隨著泌乳量的逐漸升高而體脂大量動員。

NEFA 進入肝后首先在脂酰輔酶A合成酶作用下活化為脂酰脂酰輔酶A，進一步代謝包括3種途徑：一是 NEFA 被徹底氧化成二氧化碳，所產生的能量被肝利用；二是部分氧化生成酮體，被肝外組織利用；三是再酯化形成甘油三酯、磷酯或膽固醇酯，用于極低密度脂蛋白的組裝，轉運到肝外組織利用或在肝中蓄積。反芻動物肝脂肪酸氧化或以VLDL的形式輸出甘油三酯的能力是有限的[15]，因此，如果肝攝入過多的脂肪酸，超過了肝輸出或氧化脂肪酸的能力，那么脂肪酸就會以甘油三酯的形式在肝中蓄積形成脂肪肝，而且脂肪酸的不完全氧化產物形成酮體，可能導致酮病發生[16]。而本試驗中奶牛產后血液中三羧酸含量逐漸升高，而酮體和甘油三脂未見明顯變化，這表明奶牛產后在28 d內體脂動員生成的NEFA除一小部分合成乳脂外，大部分NEFA經過β-氧化途徑被徹底氧化，釋放出大量能量以緩解產后能量的負平衡。

膽堿是動物生長發育所必需的水溶性維生素，其在動物脂肪沉積的調控中起非常重要的作用。膽堿在膽堿脫氫酶和甜菜醛脫氫酶作用下氧化生成甜菜堿，高半胱氨酸在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶作用下，可由甜菜堿提供活性甲基轉變為蛋氨酸，繼而在甲硫氨酸腺苷轉移酶作用下轉變為S-腺苷甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸是體內重要的活性甲基供體，其參與了機體內眾多的甲基代謝過程，在脂肪酸分解代謝過程中，肉堿是長鏈脂肪酸進入細胞線粒體內進行脂肪酸氧化的重要跨膜轉運載體，在脂肪酸氧化中起關鍵作用。1 分子肉堿的合成需要 3 分子 S-腺苷甲硫氨酸提供活性甲基供體。由此可見膽堿可通過膽堿氧化途徑生成甜菜堿，繼而通過蛋氨酸再甲基化途徑間接參與S-腺苷甲硫氨酸的合成，進而通過以S-腺苷甲硫氨酸為活性甲基供體的甲基代謝促進肉堿合成，增強組織中脂肪酸的氧化，提高組織對脂肪酸的降解[17-19]。增加飼料膽堿水平可明顯增強動物體內脂肪酸的氧化分解[20]。據此可以推測，奶牛產后血液中膽堿含量持續升高提示脂肪酸氧化分解持續增強。

已有研究表明，膽堿在腸道內細菌的作用下，代謝生成三甲胺(TMA)[21]，后者在黃素單加氧酶(flavine monooxygenase)的作用下在肝被氧化生成氧化三甲胺(TMAO)，因此膽堿水平升高并伴隨氧化三甲胺水平降低提示腸道菌群失調[22]。本試驗結果顯示，奶牛在產后血液中膽堿持續升高，TMAO含量持續下降，且在14 d后出現明顯改變，可能與瘤胃微生物菌群失調有關，而瘤胃微生物對葡萄糖的異生具有重要的生物學意義，產后瘤胃微生物菌群的失調可進一步加劇能量的負平衡。

綜上所述，奶牛分娩后28 d，隨著乳量的不斷增加，血糖含量降低趨勢，呈現出能量負平衡狀態，與此同時血液中不飽和脂肪酸、三羧酸、膽堿的含量逐漸升高，TMAO逐漸降低，說明機體應答性的上調了脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑以緩解奶牛分娩后的能量負平衡狀態。

4結論

采用1H-NMR代謝組學技術分析奶牛分娩后不同階段血漿小分子代謝物的變化趨勢及其對能量代謝通路的影響，篩選出8種差異標志物，代謝通路分析顯示奶牛分娩后逐漸呈現出能量負平衡狀態，機體通過上調脂肪分解、脂肪酸氧化、膽堿氧化、蛋氨酸再甲基化和甲基代謝途徑來進行調節。研究結果有望為奶牛的產后保健和預防奶牛酮病與脂肪肝等圍產期能量代謝障礙性疾病的發生提供理論依據。

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(編輯白永平)

Study on the Plasma Metabolism Using1H-NMR in Postpartum Cows

TAO Jin-zhong*，GUO Yan-sheng

(CollegeofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China)

Key words:cow；periparturition；negative energy balance；metabolomics；1H nuclear magnetic resonance

Abstract:In postpartum，cows often suffer from negative energy balance，resulting in physical dysfunction.The aim of this study was to define the physiological mechanism of cows exercising metabolic energy shortage after calving.1H-NMR technology was used for measurement of metabolites.Results were analyzed in multivariate statistical methods to find out the trend of plasma metabolites changing after calving and the influence on energy metabolism pathway.Results showed that：the biomarkers profile of plasma was not significantly different in Day 7 from Day 1 after calving；but a significant difference were found between Day 14 and Day 1 after calving.The biomarkers are unsaturated fatty acid，choline and trimethylamine oxide；There were significant differences in biomarkers profile between Day 28 and Day 1 after calving with different markers of unsaturated fatty acid，choline，trimethylamine oxide，citric acid and glucose.After calving，unsaturated fatty acid，choline and tricarboxylic acid expression gradually increased，whereas trimethylamine oxide and glucose expression gradually decreased.With the increasing lactating yield after calving，cows showed a negative energy balance.In response，the lipolysis and fatty acid oxidation，the oxidation of choline，re-methylation methionine and methyl metabolic pathways were increased，relieving the negative energy balance.This study could provide a scientific basis for the physiological mechanism of the negative energy balance after calving for dairy cows.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.027

收稿日期：2015-06-20

基金項目：國家自然科學基金(31160523)

作者簡介：陶金忠(1977-)，男，甘肅天水人，博士后，副教授，主要從事家畜繁殖及繁殖障礙的研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

*通信作者：陶金忠

中圖分類號：S857.21

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0198-09