利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)定點突變豬MSTN基因的研究

張冬杰，劉　娣，張　旭，汪　亮，楊國偉

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086)

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利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)定點突變豬MSTN基因的研究

張冬杰，劉娣*，張旭，汪亮，楊國偉

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086)

摘要：為了今后能夠有效的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因功能研究及轉(zhuǎn)基因動物的培育，本研究將帶有綠色熒光蛋白(GFP)和肌肉生長抑制素基因(Myostatin，MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入PK15細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞儀分離并收集轉(zhuǎn)染成功的陽性細(xì)胞，使用PCR擴(kuò)增結(jié)合克隆測序的方法檢測和分析CRISPR-Cas9系統(tǒng)的定點突變情況，以評價CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)挑選的100個陽性克隆中，38個發(fā)生了變異，突變效率為38%，其中32個為插入突變，6個為缺失突變。插入突變中突變1(Mutation1)所占比例最高，為47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系統(tǒng)的突變效率達(dá)到了38%，是目前進(jìn)行基因組編輯的一個有效工具，推測其突變類型具有一定的偏好性。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9系統(tǒng)；基因組編輯；突變率

CRISPR-Cas9系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是目前被廣泛關(guān)注的一種基因編輯系統(tǒng)。與鋅指核酸內(nèi)切酶(Zinc finger endonuclease，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等打靶技術(shù)相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的準(zhǔn)確性更高，成本低，易操作，無物種限制，使用上更安全。

1987年Y.Ishino等首次報道了在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR序列，但功能未知[1]。隨后，科學(xué)家們在多種細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，并在2002年由R.Jansen將其正式命名為CRISPR[2]。2011年E.Deltcheva等發(fā)現(xiàn)了一種新的與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相關(guān)的RNA，即tracrRNA(Trans-activating RNA)[3]。隨后，與E.Deltcheva同實驗室的M.Jinek發(fā)現(xiàn)并證實了Cas9是與兩種RNA(crRNAs和tracrRNA)一起行使功能的一種核酸內(nèi)切酶[4]。CRISPR-Cas9的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理基本清楚。2013年1月同時報道了2篇成功利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因定向修飾的研究結(jié)果[5-6]。開啟了利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯基因組的時代。隨后，多個研究小組實現(xiàn)了利用該系統(tǒng)同時對兩個基因、甚至更多個基因進(jìn)行定向修飾的研究[7-8]。研究對象也從最初的人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠等擴(kuò)展到豬、食蟹猴、植物等[9]。據(jù)不完全統(tǒng)計，截止到2015年2月，在PubMed數(shù)據(jù)庫中，與CRISPR-Cas9相關(guān)的論文報道達(dá)359篇。

該系統(tǒng)具有檢測遺傳編碼內(nèi)特定核苷酸順序以及在特定位置切割DNA的能力，在這一過程中，Cas9蛋白起剪刀的作用，RNA小片段起識別的作用，確保切割發(fā)生在正確的位置。但只要存在片段識別問題，就不可避免的會發(fā)生因片段相似而出現(xiàn)錯配的情況，因此，CRISPR-Cas9系統(tǒng)同樣存在著與其他基因編輯系統(tǒng)相似的問題，即“脫靶效應(yīng)”。除了小RNA錯誤識別靶序列造成脫靶效應(yīng)外，在CRISPR系統(tǒng)中使用的關(guān)鍵酶的類型也與脫靶效應(yīng)存在顯著相關(guān)[10]。脫靶效應(yīng)的存在會造成研究結(jié)果的不確定性以及研究工作的大量增加，會限制該系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。

本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，定向突變豬的Myostatin基因；利用流式細(xì)胞儀分離和篩選陽性細(xì)胞；結(jié)合序列測定的方法分析突變位點、計算打靶效率，為今后利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中豬Myostatin基因mRNA序列(GenBank登錄號：NM_214435)設(shè)計打靶位點，依據(jù)靶位點篩選原則，最終確定第3外顯子處的“TTCCAGGCGAAGTTTACTGAGG”序列為靶序列，pCMV-Cas9-GFP-MSTN質(zhì)粒定制于Sigma公司，質(zhì)粒模式圖見圖1。

1.2PK15細(xì)胞的體外培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的豬PK15細(xì)胞，迅速投入37～40 ℃水浴中不斷搖晃使其快速溶解。低溫1 000 r·min-1離心5 min，去掉上清，向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入適量的含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，緩慢吹打混勻后，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿中，再補(bǔ)足培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%左右時，倒掉原培養(yǎng)液，用無菌的D-PBS清洗細(xì)胞兩次，加入適量0.25%的含EDTA的胰蛋白酶消化液，37 ℃消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞之間不再連接成片而是變圓時加入胎牛血清終止消化，輕輕吹散細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，低溫1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，用10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重懸成單細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)皿內(nèi)補(bǔ)全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過2～3次的細(xì)胞傳代后，待細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3瞬時轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d接種豬PK15細(xì)胞于24孔板中，待細(xì)胞匯合到80%～90%時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)的細(xì)胞用DMEM(無血清)清洗兩遍，再換上新的無血清的DMEM。按摩爾濃度比為1︰100將質(zhì)粒用無血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基稀釋并混勻。將Entranster用無血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育10 min后，加入到質(zhì)粒稀釋液中，室溫孵育20 min。將細(xì)胞用無菌的PBS清洗1次，每孔加入0.5 mL無血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴入，輕輕搖晃混勻，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育4 h。溫育結(jié)束后，加入500 μL無雙抗的全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育24 h，對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選。上述試驗重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞儀分選GFP陽性細(xì)胞

使用BD公司(美國)生產(chǎn)的FACS AiralⅡ流式分選儀，采用熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)(FACS)分選收集GFP+和GFP-的PK15細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染pCMV-Cas9-GFP-MSTN質(zhì)粒的PK15細(xì)胞作為陰性對照，分選結(jié)束后抽提GFP+細(xì)胞的DNA。上述試驗重復(fù)3次。

1.5陽性細(xì)胞的克隆測序

將收集到的陽性細(xì)胞按照常規(guī)的酚-氯仿提取方法提取總DNA。用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。在靶位點兩側(cè)設(shè)計1對引物，引物序列為F：5′-CGTTTCCGTCGTAGCGTGAT-3′，R：5′-TGAATGAGAACAGCGAGCAA-3′。PCR擴(kuò)增目的片段后，回收純化目的片段，連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌落100個，LB液體培養(yǎng)基活化后，送交庫美公司測序。上述試驗重復(fù)3次。

1.6數(shù)據(jù)分析

使用MEGA6.0軟件對所測得的序列進(jìn)行比對，尤其關(guān)注靶位點區(qū)間序列的變異情況，統(tǒng)計變異類型，計算突變比例。

2結(jié)果

2.1流式細(xì)胞儀分選GFP陽性細(xì)胞

轉(zhuǎn)染了pCMV-Cas9-GFP-MSTN質(zhì)粒的PK15細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，GFP陽性細(xì)胞得率為12.6%，分離后獲得的GFP陽性細(xì)胞純度為81.5%。陰性對照組細(xì)胞的GFP陽性細(xì)胞得率為0。具體試驗結(jié)果見圖2。

2.2定點突變分析

使用MEGA6.0軟件對測得的序列進(jìn)行比對，重點關(guān)注定點突變位置“TTCCAGGCGAAGTTTACTGAGG”處的堿基變異情況。共檢測到11種突變類型，其中插入突變5種，缺失突變6種。插入突變多發(fā)生在第16和第17位堿基之間A/C處，6種缺失突變中僅有一個發(fā)生了大片段的缺失，即靶序列兩側(cè)也發(fā)生了堿基的缺失，插入突變結(jié)果見圖3，缺失突變結(jié)果見圖4。

2.3突變效率的統(tǒng)計分析

每次試驗均挑取100個陽性克隆測序，以3次重復(fù)數(shù)據(jù)的均值計算突變效率。3次重復(fù)試驗的平均突變率為38%，11種突變類型占總突變數(shù)的比例見表1。

表111種突變類型個體數(shù)占總突變數(shù)的比例

Table 1The ratio of individuals with 11 mutation types to total mutation number

3討論

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是最新發(fā)現(xiàn)的一種基因組編輯技術(shù)，是由細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成。該系統(tǒng)的作用原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(Trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人工設(shè)計這兩種RNA，改造成具有引導(dǎo)作用的sgRNA(Short guide RNA)，以引導(dǎo)Cas9對DNA的定點切割。因此，在最早利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯的研究中，tracrRNA/crRNA復(fù)合物和Cas9蛋白是作為兩個獨立的單元發(fā)揮作用。后來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，作為一種RNA導(dǎo)向的雙鏈DNA結(jié)合蛋白，Cas9核酸酶是目前已知的第一個統(tǒng)一因子，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的Cas9融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)膕gRNA，可靶定任何雙鏈DNA序列，而RNA可鏈接到sgRNA的末端，不影響Cas9的結(jié)合，因此，Cas9能在任何雙鏈DNA序列處帶來任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力[11]。本研究中所用到的pCMV-Cas9-GFP-MSTN質(zhì)粒，即采用了將gRNA和Cas9構(gòu)建于同一個質(zhì)粒上的策略。同時該質(zhì)粒還插入了綠色熒光蛋白(GFP)基因，可在細(xì)胞水平上檢測轉(zhuǎn)染效率。

針對哺乳動物細(xì)胞的研究表明，sgRNAs和基因組DNA之間錯配堿基的數(shù)量、位置和分布是影響脫靶效率和突變效率的一個主要因素。為了減少脫靶效率，sgRNA的總體設(shè)計原理即是將sgRNAs的錯配率降至3個或3個以下。但是也有研究表明，sgRNAs的20個堿基中，只有靠近PAM(Protospacer-adjacent motif)處的5～12 bp堿基是“核心序列”，顯著影響突變效率，而位于PAM末端核酸的錯配對突變效率的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于“核心序列”。此外，CRISPR/Cas9對靶基因的識別是通過RNA與DNA的結(jié)合，二者結(jié)合的牢固性也是容易造成脫靶的另一個原因[12]。

本研究中所獲得的MSTN基因38%的突變效率高于利用該系統(tǒng)突變羊MSTN基因的效率(19.3%)[13]，但顯著低于在大鼠胚胎中單敲除Tet-3基因的效率(100%)[14]。在人類293T細(xì)胞中突變AAVS1的效率為10%～25%，在K562細(xì)胞中突變該基因的效率為8%～13%[15]。在果蠅胚胎中突變yellow gene的最高效率為88%，white gene的最高效率為25%[16]。已有的研究結(jié)果表明，不同物種、不同細(xì)胞系、不同基因的敲除效率不盡相同，這說明CRISPR-Cas9系統(tǒng)的突變效率除了受到自身結(jié)構(gòu)的影響，還受到許多其他因素的影響。

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(編輯郭云雁)

Study of PigMSTNGene Point Mutation Based on the CRISPR-Cas9 System

ZHANG Dong-jie，LIU Di*，ZHANG Xu，WANG Liang，YANG Guo-wei

(InstituteofAnimalHusbandry，HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150086，China)

Key words:CRISPR-Cas9 system；genome editing；mutation rate

Abstract:In order to more effectively apply CRISPR-Cas9 in researches on gene functions and transgenetic animals，we transfected the PK15 cell line with the CRISPR-Cas9 system containing GFP andMyostatin.Positive cells were separated and collected by flow cytometry.Point mutations were detected and analyzed by PCR and DNA sequencing.The results showed that，among 100 randomly-selected positive clones，the mutation rate was 38%，including 32 insertions and 6 deletions.Mutant 1(one of the insertions) had the highest frequency(47.4%).In this experiment，the mutation rate of CRISPR-Cas9 system is 38% and certain mutation type bias is observed.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.028

收稿日期：2015-01-07

基金項目：哈爾濱市科技局項目(2013RFQYJ037)

作者簡介：張冬杰(1980-)，女，黑龍江樺南人，副研究員，博士，主要從事豬分子遺傳學(xué)研究，Tel：0451-87502330，E-mail：djzhang8109@163.com *通信作者：劉娣，教授，E-mail：liudi1963@163.com

中圖分類號：S828；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0207-06