寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌毒力基因檢測和耐藥性分析

張金寶，馬春芳，余　婷，李曉娜，魏小平，王桂琴*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021； 2.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004；3.吳忠市紅寺堡區農牧和科技技術局，吳忠 751999)

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寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌毒力基因檢測和耐藥性分析

張金寶1，馬春芳2，余婷1，李曉娜1，魏小平3，王桂琴1*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021； 2.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004；3.吳忠市紅寺堡區農牧和科技技術局，吳忠 751999)

摘要：為了解寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性及毒力基因、耐藥基因的分布情況，采用K-B法測定從奶牛乳房炎病例分離的197株大腸桿菌對16種抗菌藥物的敏感性，并采用PCR技術對大腸桿菌毒力基因及耐藥基因進行檢測。結果顯示，大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高，達到54.69%，對多西環素、四環素和鏈霉素的耐藥率在39%左右，而對頭孢唑啉、頭孢噻肟、多黏菌素、氟苯尼考和喹諾酮類藥物則比較敏感，敏感率都在60%以上。基因檢測結果顯示，除sta、stx2e這2種毒力基因未被檢測到，astA、escV、eaeA、sepA、hlyA5種毒力基因的檢出率分別是20.30%、14.72%、8.12%、2.03%、1.02%。四環素類的2種耐藥基因均被檢測到，其中tetC的陽性率為24.87%。氟喹諾酮類的GyrA、GyrB、ParC三種耐藥突變的檢出率分別高達97.46%、98.98%、98.48%。寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌攜帶astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介導四環素類、氟喹諾酮類耐藥的基因，對16種抗菌藥物具有不同程度的耐藥性，且存在多重耐藥菌株。

關鍵詞：大腸桿菌；毒力基因；耐藥基因；耐藥性

1885年，澳大利亞醫學家Escherich首次發現了大腸埃希菌，又稱大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)。最初一直當作是正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉，部分學者才逐漸認識到一些特殊血清型的大腸埃希菌對人和動物有致病性，特別對嬰兒和幼畜，常引起嚴重腹瀉、豬水腫病、敗血癥、新生兒腦膜炎及腎炎等[1]，還可引起畜禽生長發育遲緩，生產能力低下，甚至造成死亡，給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。致病性大腸埃希菌是引起許多疾病的罪魁禍首，并可以通過食物、水源等方式傳播，從而引發疫情[2-4]。

為了解寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌的耐藥情況，本試驗根據CLSI[6](美國臨床實驗室標準委員會)方法對寧夏地區奶牛乳房炎病例分離鑒定出的197株牛源大腸桿菌進行了藥物敏感性測定。同時采用PCR技術對其毒力基因以及耐藥基因進行檢測，初步分析兩者之間的相關性，以期得到寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性的規律，并指導臨床合理用藥。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株質控菌株大腸桿菌ATCC25922購自中國藥品生物制品檢定所；試驗用大腸桿菌分離自寧夏地區部分奶牛場采集的奶牛乳房炎乳樣。

1.1.2主要試劑及抗菌藥物藥敏紙片科瑪嘉大腸桿菌顯色培養基購自CHRO Magar公司；Gelred染料購自Biotium公司；DNA marker 購自上海生工公司；2×Taq MasterMix酶購自北京康為世紀生物科技有限公司；BHI肉湯、LB肉湯、麥康凱瓊脂等購自北京奧星博生物技術有限公司；氨芐西林(10 μg·片-1)、頭孢唑啉(30 μg·片-1)、慶大霉素(10 μg·片-1)、環丙沙星(5 μg·片-1)、多西環素(30 μg·片-1)、卡那霉素(30 μg·片-1)、氧氟沙星(5 μg·片-1)、鏈霉素(10 μg·片-1)、頭孢噻肟(30 μg·片-1)、四環素(30 μg·片-1)、阿米卡星(30 μg·片-1)、氟苯尼考(30 μg·片-1)、諾佛沙星(10 μg·片-1)、恩諾沙星(5 μg·片-1)、復方新諾明(30 μg·片-1)、多黏菌素(300 μg·片-1)購自Oxoid Limited。

1.1.3主要儀器設備立式壓力蒸汽滅菌鍋，購自上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱THZA，購自上海一恒科技有限公司； SW-CJ蘇凈安泰潔凈工作臺，購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術公司；電子天平，購自北京塞多利斯儀器有限公司；PCR反應儀和凝膠成像儀，購自Biotium-rad公司；DYY-6C型電泳儀，購自北京六一儀器廠。

1.2大腸桿菌的分離鑒定

1.2.1樣品采集對奶牛進行乳房炎檢測，采集隱性和臨床型乳房炎奶樣，按常規擠奶消毒后，每個乳頭擠去前2～3把乳后，無菌取奶樣5 mL左右，貼好標簽，4 h內送實驗室進行處理。

1.2.2分離純化和初步鑒定將采集的乳樣用滅菌的棉簽涂于麥康凱培養基上，置于37 ℃培養16～24 h，挑取單個典型菌落涂片，革蘭染色進行鏡檢，觀察細菌形態及染色特性，進行初步鑒定。再將鏡檢后的疑似大腸桿菌的菌落劃線接種于新鮮制備的科瑪嘉大腸桿菌顯色培養基平板上，37 ℃培養16～24 h后，觀察其菌落形態特征，挑取藍色的單個菌落于BHI肉湯中，置于培養箱中37 ℃培養16～24 h，保存備用。

1.2.3PCR鑒定大腸桿菌根據文獻和GenBank已發表的序列，確定16S rDNA引物[5]。16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。PCR反應條件：預變性94 ℃5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環；72 ℃延伸5 min。配制凝膠進行電泳并進行DNA凝膠回收，將回收產物送至上海英濰捷基貿易有限公司進行測序。

1.3藥敏試驗

嚴格按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)2012年推薦的抗微生物藥物敏感性試驗執行標準[6]進行藥敏試驗。

1.4毒力基因和耐藥基因的檢測

根據文獻[7-13]和GenBank上已公布的序列，確定7種毒力基因和5種耐藥基因的引物序列，見表1。

表1毒力基因和耐藥基因的引物序列

Table 1Primer sequences of virulence genes and resistance genes

PCR反應體系為25 μL：上游(F)、下游(R)引物各0.5 μL；2×TaqMasterMix酶 12.5 μL；ddH2O 11 μL；細菌DNA模板0.5 μL。PCR產物進行電泳，將電泳凝膠回收后送至上海英濰捷基貿易有限公司測序。

2結果

2.1大腸桿菌初步鑒定

將采集的乳房炎奶樣經過麥康凱培養基初步培養，再經科瑪嘉大腸桿菌顯色培養基篩選，可見邊緣整齊，濕潤光滑的藍色菌落，初步分離鑒定出疑似大腸桿菌204株。

2.2大腸桿菌PCR鑒定

采用PCR技術對204株疑似大腸桿菌進行16S rDNA檢測，電泳產物回收后進行測序，將全部測序結果進行比對后，確定大腸桿菌197株。

2.3藥敏試驗

197株大腸桿菌對臨床常用的16種抗菌藥物的耐藥情況見表2，分離菌株對16種抗菌藥物具有不同程度的耐藥性。其中對氨芐西林耐藥率最高，達到54.69%，其次，對多西環素(39.59%)、四環素(39.09%)和鏈霉素(38.58%)的耐藥率也較高，而對頭孢類、多黏菌素、氟苯尼考和喹諾酮類藥物則比較敏感，敏感率都在60%以上。

2.4大腸桿菌臨床分離株多重耐藥情況

本次試驗分離的197株奶牛乳房炎大腸桿菌多重耐藥情況見圖1，對所有抗菌藥物都敏感的菌株有30株，僅對一種藥物耐藥的有51株。多重耐藥中7耐、5耐和11耐的菌株較多，所有菌株最多對15種抗菌藥物耐藥。

2.5毒力基因和耐藥基因的檢測

在7種毒力基因中，有5種毒力基因擴增出相應大小的目的片段，分別是astA、escV、eaeA、sepA、hlyA，而sta、stx2e沒有擴增出相應大小的目的片段；5種耐藥基因tetB、tetC、GyrA、GyrB、ParC全部擴增出相應大小的目的片段。

2.6197株大腸桿菌毒力基因及耐藥基因的測序比對

對197株寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌毒力基因及耐藥基因進行了測序比對。結果(表3)顯示，未檢測到sta和stx2e這2種毒力基因，astA、escV、eaeA、sepA4種毒力基因的檢出率分別是20.30%、14.72%、8.12%、2.03%，而毒力基因hlyA的檢出率最低，為1.02%。耐藥基因中，四環素類的2種耐藥基因tetC、tetB陽性率分別為24.87%、7.61%；氟喹諾酮類的三種耐藥基因GyrA、GyrB、ParC檢出率都很高，分別為97.46%、98.98%、98.48%。

表2大腸桿菌藥敏試驗結果

Table 2The susceptibility test results ofEscherichiacoli

3討論

3.1藥敏試驗結果顯示，寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌普遍對氨芐西林、四環素、鏈霉素和慶大霉素等藥物具有一定的耐藥性，而對諾氟沙星、阿米卡星、環丙沙星、氟苯尼考等藥物的耐藥率較低，且存在多重耐藥菌株。所以在臨床用藥要盡量避免使用氨芐西林、多西環素、四環素、新諾明和鏈霉素等藥物。

3.2尹召華[14]研究結果顯示，毒力基因hlyA的陽性分離率是6.5%。楊少華等[15]研究顯示，從兔場分離到的171株大腸桿菌中，eaeA基因的檢出率為72.7%，說明該基因是導致兔腹瀉的主要病原。本研究中未檢測出sta、stx2e，其余幾種毒力基因檢出率較低，astA、eaeA等基因在寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌中檢出率相對較高。黃名錢[16]研究顯示，對四環素耐藥的10株菌株中，tetB基因的陽性檢出率為20%，tetC基因的陽性檢出率為90%。F.A.Neela等、劉維紅[17-18]研究表明，四環素類藥物一般較多使用的為四環素，這種藥物的作用機制可能與耐藥基因tetB、tetC有關。本研究中，四環素類的2種耐藥基因均被檢測到，其中tetC陽性率為14.72%；氟喹諾酮類的GyrA、GyrB、ParC三種耐藥突變均被檢測到，而且檢出率都很高，達到97.46%、98.98%、98.48%。由此可以看出，寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌攜帶astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介導四環素類、氟喹諾酮類耐藥的基因。

表3毒力基因及耐藥基因檢測結果及測序比對結果

Table 3The detection rate and sequencing positive strain ratio results of virulence gene and resistance gene

3.3作者對擴增的GyrA、GyrB、ParC基因的PCR產物進行測序，并進行序列比對分析。根據GenBank已發表的序列，進行GyrA基因比對，在比對序列的813個堿基中發現，第10位多了1個堿基G，第429、690、723位均為G→A，第555位G→C，第750、768、775位均為A→G。GyrB基因測序比對的857個堿基中發現，第460、736、787位T→C，第685、775位C→T，第769位A→G。ParC基因測序比對的909個堿基中發現，第903位多了一個堿基T。近幾年，GyrA基因的第83、87位點是熱點突變，83位絲氨酸突變為亮氨酸或色氨酸時，則是大腸桿菌對喹諾酮類藥物表現高水平耐藥的原因之一。劉曉強[19]研究表明大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥水平的高低和其靶基因突變數目有著密切的關系，單一的突變只能導致低水平的耐藥，高水平的耐藥需要多個位點的突變。此次試驗只涉及到PCR產物測序分析其部分片段的基因突變、缺失等，其是否會影響到大腸桿菌對該類藥物的耐藥水平還有待進一步研究。

4結論

寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌攜帶astA、eaeA、sepA、escV、hlyA等毒力基因和介導四環素類、氟喹諾酮類耐藥的基因，對16種抗菌藥物具有不同程度的耐藥性，且存在多重耐藥菌株。

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(編輯白永平)

Detection of Virulence Genes and Antimicrobial Resistance Analysis ofEscherichiacoliIsolated from Dairy Cow Mastitis in Ningxia

ZHANG Jin-bao1，MA Chun-fang2，YU Ting1，LI Xiao-na1，WEI Xiao-ping3，WANG Gui-qin1*

(1.CollegeofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；2.Collegeofpharmacy，NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China；3.TechnologyBureauofHongsipuAgriculturalandAnimalHusbandry，Wuzhong751999，China)

Key words:Escherichiacoli；virulence genes；resistance genes；antimicrobial resistance

Abstract:The objectives of this study were to investigate resistance，virulence genes and resistance genes ofEscherichiacoliisolated from dairy cow mastitis in Ningxia.The antimicrobial resistance of 197Escherichiacolifrom dairy cow mastitis cases to 16 drugs was determined by the methods of K-B and the virulence genes and resistance genes were detected by PCR.The results showed that the resistance rate of ampicillin was the highest and it achieved 54.69%.Furthermore，the resistance rates of doxycycline，tetracycline and streptomycin were about 39%.It was more sensitive to cephazolin，cefotaxime，polymyxin，florfenicol，quinolones，and the sensitive rates were above 60%.The results of genes detection showed that the detection rates of virulence genesastA，escV，eaeA，sepA，hlyAwere 20.30%，14.72%，8.12%，2.03% and 1.02% respectively.The virulence genesstaandstx2ewere not detected.Tetracycline resistant genes were detected and the detection rate oftetCwas 24.87%.The detection rate of fluoroquinolone resistance genesGyrA，GyrBandParCwere 97.46%，98.98% and 98.48%，respectively.Our study demonstratesEscherichiacoliisolates from dairy cow mastitis in Ningxia carrying virulence genesastA，eaeA，sepA，escV，hlyAand the genes mediate resistance to tetracyclines，fluoroquinolones，and those isolates have varying degrees of resistance 16 kinds of antibacterial drugs，and some isolates are multi-resistant strains.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.024

收稿日期：2015-06-08

基金項目：國家自然科學基金(31160519)

作者簡介：張金寶(1990-)，男，回族，寧夏西吉人，碩士生，主要從事獸醫藥理學與毒理學研究，E-mail：hxzhjb@163.com *通信作者：王桂琴(1970-)，女，河北清苑人，教授，博士，主要從事獸醫藥理學與毒理學研究，E-mail：nxwgq@126.com

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0177-06