基于454高通量測序平臺血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測

韓 娜強裕俊張婷婷苗嬌嬌張 雯*（1 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310003）

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基于454高通量測序平臺血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測

韓 娜1，2強裕俊1，2張婷婷1，2苗嬌嬌1，2張 雯1，2*
（1 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310003）

【摘要】目的 探討454高通量測序平臺應用于臨床樣本快速檢測的可能性。方法 應用454高通量測序平臺測定血液、呼吸道和消化道臨床樣本中微生物菌群的16S rDNA基因的V3-V4高變異區(qū)段序列，采用BLAST方法與RDP數(shù)據(jù)庫進行比對，基于比對結(jié)果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數(shù)。結(jié)果 8份臨床模擬樣本中，7份檢測出目標菌屬，檢出率為87.5%。在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態(tài)下的無菌體液，檢測結(jié)果較為明確，檢出的細菌較為集中，顯示了檢測結(jié)果的可靠性。而對本身含有較多種類細菌的糞便樣本，其目標菌比例明顯降低。結(jié)論 實現(xiàn)了80 h內(nèi)得到血液、呼吸道和消化道臨床樣本中含有病原菌情況的檢測報告，并探討了高通量測序技術(shù)在今后臨床實際應用時進一步提高檢測速度和靈敏度的方法。

【關(guān)鍵詞】454高通量測序；臨床樣本；病原菌；檢測

16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括10個保守區(qū)域（conversed regions）和9個高變區(qū)域（hypervariable regions），其中保守區(qū)在細菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同而有一定的差異［1］。因此，16S rRNA可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標［2］。然而16SrRNA的檢測前提是需要病原的分離培養(yǎng)。雖然人們已通過實驗室培養(yǎng)分離并保存了部分穩(wěn)定的菌株，但實際上目前僅有上千種（Species水平）的微生物基因組獲得了成功測序；99%的環(huán)境微生物，尤其以厭氧和極端環(huán)境生存菌，仍無法分離純化而實現(xiàn)實驗室培養(yǎng)或尚未成功建立培養(yǎng)體系［3］。由于技術(shù)有限性導致對大量微生物表型、遺傳信息的認知局限性，大大限制了我們對這些未知菌種的研發(fā)和利用，也限制了我們進一步解析微生物和人類健康間的關(guān)聯(lián)性。

近年來隨著高通量測序平臺和技術(shù)的不斷革新，宏基因組研究，不依賴于培養(yǎng)技術(shù)，以整個微生物群落遺傳物質(zhì)為研究對象，大力推動了整個微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能基因組學研究的迅速發(fā)展，促使人們不斷深入了解這些微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能、進化以及群落間，群落與環(huán)境間的相互作用關(guān)系，以及微生物和人類健康間的關(guān)聯(lián)性［4-5］。本課題組在前期的工作中，也利用宏基因組學方法（16S Meta）探索了人類腸道的菌群結(jié)構(gòu)變化和兒童腹瀉、糖尿病等多種疾病之間的關(guān)聯(lián)性［6-7］。然而目前仍缺乏基于16s rDNA的未知病原菌高通量篩查技術(shù)，如何利用宏基因組技術(shù)從患者身上快速檢測出病原菌仍是傳染病工作目前發(fā)展的技術(shù)難題。在本研究中，本課題組利用454測序平臺，對血液、呼吸道和消化道的臨床模擬樣本進行了16S rDNA宏基因組測序，基于測序結(jié)果進行了未知病原檢測，實現(xiàn)了80 h內(nèi)完成8份模擬臨床樣本的檢測，對探索高通量測序方法在臨床檢測方面的應用做出了一定的貢獻。

1 資料與方法

1.1 樣本準備：收集8份健康人的樣本，分別為灌洗液、咽拭子、血液和糞便，分別添加8種不同的病原菌（表1），濃度為～104ccfu/g。

1.2 核酸提取：8份模擬樣本的核酸提取是利用Qiagen UCP Pathogen Mini Kit試劑盒。提取方法詳細如下：加40 μL Proteinase K，渦旋器混合樣本10 s；56 ℃孵化10 min；加200 μL Buffer APL2到樣本，蓋上蓋子，多脈沖渦旋器震蕩混合30 s；70 ℃孵化10 min；瞬時離心，將蓋子上的液體滴落；加300 μL乙醇到裂解液中，蓋上蓋子，多脈沖震蕩漩渦器震蕩15～30 s混合均勻；加混合物到QIAamp UCP Mini spin column柱子上，6000×g（8000 rpm）離心1 min；小心打開離心柱，加600 μL Buffer APW1，避免污染柱子邊緣，6000×g（8000 rpm）離心1 min；加750 mL Buffer APW2，全速（20000×g，14000 rpm）離心3 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，棄置含廢液的收集管。全速離心1 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，打開蓋子，56 ℃孵化整個裝置3 min，將膜徹底干燥；將離心柱放置到新的1.5 mL洗脫管中，棄置收集管，小心加20～100 μL Buffer AVE到離心柱的中央。蓋上蓋子，室溫靜止1 min；全速離心（20000×g，14000 rpm）1 min，洗脫DNA。

表1 8份模擬樣本的詳細信息。

1.3 高通量測序：基于454測序平臺進行測序，按照454 Junior測序平臺標準操作手冊進行。工作流程見圖1。

1.4 數(shù)據(jù)分析：測序序結(jié)果，利用FastQC進行質(zhì)量控制。剔除低質(zhì)量序列后，我們采用BLAST方法與RDP數(shù)據(jù)庫進行比對，基于比對結(jié)果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數(shù)。

2 結(jié) 果

2015年10月13日9：00實驗室取樣，依次進行核酸提取、16S擴增、建庫、油包水實驗、測序和數(shù)據(jù)分析步驟（如圖1所示），于10月16日17：35生成鑒定報告，總工作時間80 h。所需人力3名，其中實驗室人員2名，數(shù)據(jù)分析人員1名。

樣本一為肺泡灌洗液模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為773。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有458條序列與軍團菌屬匹配，比例為59.64%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有348條序列與目標菌嗜肺軍團菌匹配，比例為45.44%。檢測結(jié)果為陽性。

表2 8份臨床模擬樣本的檢測結(jié)果

圖1 工作流程及時間

樣本二為咽拭子模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為10376。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有9725條序列與不動桿菌屬匹配，比例為94.07%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有348條序列與目標菌不動桿菌屬匹配，比例為42.88%。檢測結(jié)果屬水平上為陽性。

樣本三為血液模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為1279。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有1006條序列與李斯特菌屬匹配，比例為78.66%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有915條序列與目標菌李斯特菌屬匹配，比例為71.54%。檢測結(jié)果屬水平上為陽性。

樣本四為糞便模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為3262。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫和16S數(shù)據(jù)庫比對，皆無序列與空腸彎曲菌匹配。檢測結(jié)果為陰性。

樣本五為糞便模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為7375。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有1425條序列與弧菌屬匹配，比例為19.42%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有384條序列與目標菌副溶血弧菌匹配，比例為5.23%。檢測結(jié)果為陽性。

樣本六為糞便模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為7464。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有81條序列與弧菌屬匹配，比例為1.09%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有4條序列與目標菌弧菌屬匹配，比例為0.06%。檢測結(jié)果屬水平上為陽性。

樣本七為糞便模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為425。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有150條序列與沙門菌屬匹配，比例為36.08%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有107條序列與目標菌腸道沙門菌匹配，比例為25.18%。檢測結(jié)果為陽性。

樣本八為糞便模擬樣本，測序序列數(shù)（read）為1484。經(jīng)過與RDP數(shù)據(jù)庫比對，有1條序列與氣單胞菌屬匹配，比例為0.07%。通過與16S數(shù)據(jù)庫比對，有2條序列與目標菌嗜水氣單胞菌匹配，比例為0.13%。檢測結(jié)果為陽性。

8份臨床模擬樣本中，7份檢測出目標菌屬，檢出率為87.5%。詳細檢測結(jié)果請見表2。

3 討 論

目前臨床上，常規(guī)培養(yǎng)、生化血清學鑒定方法仍是主流的檢測方法，但存在檢出率低和漏檢率高的缺點。基于特異序列的PCR方法靈敏度高、檢測速度快，但只能針對一種或幾種特定的菌進行鑒定，不利于用于未知病原的篩查。高通量測序檢測方法由于其數(shù)據(jù)量大，不依賴于細菌培養(yǎng)，一經(jīng)面世就被寄予了解決未知病原檢測問題的厚望，本研究模擬臨床實戰(zhàn)，從樣本接受到返回報告，實現(xiàn)了80 h內(nèi)的得到檢測報告，檢出率高達87.5%，具有較高的敏感性。然而目前的實驗的樣本數(shù)還較少，其敏感性和特異性還需要大數(shù)據(jù)量的進一步的驗證。此外，本次實驗也反映出了一些問題。

首先，檢測時間需要80 h，從臨床應急的角度仍需進一步的壓縮。為解決以上問題，我們計劃采取硬件和軟件一起優(yōu)化的策略。在硬件上，升級測序平臺，改用測序時間更短的新一代測序儀；在軟件上，實現(xiàn)人員的合理配置，從現(xiàn)在的單班8小時工作優(yōu)化為雙組輪班制，以最大可能的壓縮閑置時間。

其次，目前的檢測結(jié)果顯示在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態(tài)下的無菌體液，檢測結(jié)果較為明確，檢出的細菌較為集中，目標菌比例超過50%，最高超過94%，顯示了檢測結(jié)果的可靠性。而對本身含有較多種類細菌的糞便樣本，其目標菌比例明顯降低。這提示了我們未來在對有菌體液，如糞便樣本的檢測中，需要提高測序數(shù)據(jù)量，以盡可能覆蓋目標菌群，提高檢測的陽性率。

最后，目前的檢測結(jié)果仍局限于屬水平上，在種水平上由于目前的16S數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量較小的原因，很多病原菌在種水平上不能檢出。因此，我們需要針對常見的病原菌擴增16S全長，補充到我們目前的數(shù)據(jù)庫中，以提高檢測精確度。

綜上所述，454高通量測序平臺可用于臨床樣本的快速檢測，且

中圖分類號：R446

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）17-0039-03

基金項目：國家自然科學基金青年基金（課題編號81201322）和國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃課題（2014AA021505）

*通訊作者：E-mail：Zhangwen@icdc.cn