Lv—shRNA—Hsa—microRNA—691慢病毒表達載體的構建與鑒定

何燕浙 唐德軍

【摘要】目的：構建 Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表達載體。

方法： 雙酶切及測序鑒定正確后進行慢病毒包裝與滴度檢測。構建成功后感染人胰腺癌細胞Panc-1， 48h后Real-time Q-PCR檢測miR-691的表達。

結果：病毒感染后的Panc-1胰腺癌細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，Real-time Q-PCR顯示被感染細胞的miR-691表達量較未感染細胞顯著增高。

結論：建立了高效穩定表達Lv-shRNA-hsa-miR-691 的慢病毒轉染系統。

【關鍵詞】microRNA； Lv-shRNA-hsa- miR-691； 慢病毒表達載體

microRNA是近年來在人體中發現一類長度約為22個核苷酸左右的非編碼RNA，它不直接參與蛋白質的合成，通過對人體1/3左右的mRNA進行調節，控制著細胞分化、增殖和凋亡等生命活動，并能夠特異性靶向mRNA實現對其轉錄后抑制[1]。已有的研究表明：波形蛋白作為胰腺癌上皮-間質化標志蛋白之一，與胰腺癌的侵襲轉移密切相關[2， 3]。通過生物性息學預測Lv-shRNA-hsa-miR-691可靶向調控波形蛋白的表達。本研究旨在構建針對Lv-shRNA-hsa-miR-691高效的慢病毒表達系統，為深入研究其靶向調控波形蛋白的表達對胰腺腫瘤細胞侵襲轉移提供一種研究工具。

1.材料和方法

1.1 材料

1. 質粒、菌株和細胞及主要酶和試劑

慢病毒質粒pLenti-CMV-GFP Puro （658-5）、包裝質粒pCMVDR8.74 和 pMD2.G購自Addgene公司；大腸桿菌菌株PANC-1細胞妥善保存。限制性內切酶AgeI、EcoR I、T4 連接酶購自Takara公司；； 總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；Fugene HD轉染試劑購自Roche公司；Lv-shRNA-hsa-miR-691定量PCR引物及miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司。

1.2 方法

慢病毒制備 滴度測定及在胰腺癌細胞中的表達

將DNA混合物加至100μl Fugene HD轉染試劑中，加入培養瓶，轉染24h后，加入 20ml Virus Production培養基，轉染44-48h，收集上清液到離心管內。將收集的上清液4℃，1000 rpm/min，離心5min，取上清超速離心，風干；后每管加入30ml 病毒上清，然后將2ml的20%蔗糖溶液（PBS配制）加入上清液的底部，平衡后4℃，25000 rpm/min，離心2h。離心完畢后棄去上清液，管底白色沉淀晾干后加入100u l冷PBS重懸，輕輕吹打溶解后收集病毒，分裝5μl/管，-80℃凍存。

胰腺癌細胞PANC-1接種。待細胞覆蓋至70%左右時，取其中3孔，以感染復數（MOI=4：1）比例加入LV-plenti-GFP-miR-691感染胰腺癌細胞PANC-1，觀察綠色熒光蛋白表達情況。

1.3 統計學處理：

采用t檢測，由SPSS 17.0統計軟件分析結果。檢測水準為P（雙側）<0.05。

2 結果：

LV-plenti-GFP-miR-691感染PANC-1細胞，GFP表達綠色熒光呈高峰。Real-time Q-PCR檢測Lv-shRNA-hsa-miR-691在PANC-1細胞中表達結果，其表達量結果顯示LV-plenti-GFP-miR-691病毒感染較對照組的miR-691表達顯著升高200多倍。

3 討論

miR-691主要存在于胎肝、中樞神經、空腸、甲狀腺在大多數成熟的器官和組織包括胰腺不表達[5]。研究表明miR-691在多種腫瘤中表達失調，其可能參與了多種惡性腫瘤的發生發展。最近研究表明：miR-691能抑制頭頸部鱗癌的侵襲轉移，促進癌細胞凋亡[6]；miR-691在胰腺癌中的表達情況及其作用亦未見研究報道。

本研究成功構建Lv-shRNA-hsa-miR-691 慢病毒表達系統，經雙酶切測序分析，與Sanger miRBase中的序列一致，沒有堿基缺失或替換；包裝成慢病毒感染胰腺癌細胞PANC-1后能穩定高效地表達成熟Lv-shRNA-hsa-miR-691，為深入研究Lv-shRNA-hsa-miR-691的生物學功能和作用機制提供強有力的工具。

【References】

[1]Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function. Cell. 2004. 116（2）： 281-97.

[2]Vasko V， Espinosa AV， Scouten W， et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. 104（8）： 2803-8.

[3]慢病毒載體介導RNA干擾體外抑制人胰腺癌細胞VIM基因的表達（英文）. Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2009. （03）： 145-149.

[4]Liang Y， Ridzon D， Wong L， Chen C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 2007. 8： 166.

[5]Liu X， Chen Z， Yu J， Xia J， Zhou X. MicroRNA profiling and head and neck cancer. Comp Funct Genomics. 2009 ： 837514.

[6]Cockrell AS， Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007. 36（3）： 184-204.