脈復生對急性血瘀模型大鼠血液流變學及凝血功能的影響

李麗明，齊耀群，2，李阿榮，3，李常青，郭潔文，劉若軒，鄧志軍

（1.廣州市中醫醫院，廣東廣州　510130；2.廣州中醫藥大學2014級研究生，廣東廣州　510006；3.廣州中醫藥大學2013級研究生，廣東廣州　510006；4.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州　510405）

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脈復生對急性血瘀模型大鼠血液流變學及凝血功能的影響

李麗明1，齊耀群1，2，李阿榮1，3，李常青4，郭潔文1，劉若軒1，鄧志軍1

（1.廣州市中醫醫院，廣東廣州510130；2.廣州中醫藥大學2014級研究生，廣東廣州510006；3.廣州中醫藥大學2013級研究生，廣東廣州510006；4.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405）

摘要：【目的】觀察脈復生對急性血瘀模型大鼠血液流變學及凝血功能的影響。【方法】選用60只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組（100 mg/kg阿司匹林）以及脈復生高、中、低劑量組（劑量分別為10、5、2.5 g·kg-1·d-1），連續灌胃給藥1周。末次給藥后，采用各大鼠注射腎上腺素加冰浴法復制急性血瘀模型，測定各組大鼠血液流變學、凝血功能、紅細胞壓積和沉降率、血小板和紅細胞電泳時間、血小板聚集率；采用酶聯免疫吸附法測定血漿P選擇素、血栓調節蛋白含量。【結果】與空白對照組比較，模型對照組大鼠的凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）均顯著縮短（P<0.01），而血漿P選擇素、血栓調節蛋白、纖維蛋白原（FIB）的含量均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；與模型對照組比較，脈復生組可顯著降低血液流變參數，延長凝血酶時間、凝血活酶時間和凝血酶原時間，降低纖維蛋白原含量、血漿P選擇素、血栓調節蛋白（P<0.05或P<0.01）；與空白對照組比較，模型對照組血小板和紅細胞電泳時間顯著縮短（P< 0.05或P<0.01），脈復生組可延長血小板和紅細胞的電泳時間（P<0.05或P<0.01）。【結論】脈復生通過介導血漿P選擇素和血栓調節蛋白而改善急性血瘀大鼠的血液流變性和凝血功能。

關鍵詞：脈復生；急性血瘀模型大鼠；血液流變性；凝血功能；血漿P選擇素；血栓調節蛋白；FIB；PT；APTT；TT

Results Compared with the blank group，prothrombin time（PT），activated partial thromboplastin time（APTT），and thrombin time（TT）of the model group were shortened（P<0.01），and the contents of plasma P-selectin，thrombomodulin and fibrinogen（FIB）were enhanced（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the model group，blood hemorheology indexes were reduced，PT，APTT，and TT were prolonged，and plasma P -selectin，thrombomodulin and FIB of Maifusheng groups were decreased（P<0.05 or P<0.01）.Platelet and erythrocyteelectrophoresis time was shortened in the model group（P＜0.05 or P＜0.01 compared with that in the blank group），and then was prolonged after treated with Maifusheng（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Maifusheng can improve hemorheology and blood coagulation function of acute blood stasis rats through regulating P-selectin and thrombomodulin expression.

plasma p-selectin；thrombomodulin；FIB；PT；APTT；TT

脈復生是廣州市中醫醫院研制并用于治療血栓閉塞性脈管炎（TAO）的特色中藥制劑，前期研究證實其能對抗血小板聚集和血栓的形成、抑制動脈血管內皮細胞的凋亡和羥脯氨酸與糖胺多糖的合成［1-2］。本研究通過大鼠腹腔注射去甲腎上腺素結合冰水浴的方法建立急性血瘀模型，研究脈復生對急性血瘀證大鼠血液流變性及凝血功能的改善作用，為深入闡明脈復生的藥效物質基礎及治療作用機制、提高用藥的安全性提供科學依據，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量220～250 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0002，實驗前在實驗環境下適應性飼喂1周。

1.2主要試劑與藥物脈復生合劑為廣州市中醫醫院院內制劑，由牛大力30 g、熟地黃20 g、白花蛇舌草20 g等藥物組成；鹽酸腎上腺素注射液購于福州海王福藥制藥有限公司（批號：20140718）；阿司匹林腸溶片購于山東新華制藥股份有限公司（批號：20131122）；凝血酶原時間（PT，批號：20140507）、活化部分凝血活酶時間（APTT，批號：20140613）、凝血酶時間（TT，批號：20140422）、纖維蛋白原（FIB，批號：20141002）檢測試劑盒均購于南京建成生物科技有限公司；大鼠血漿P選擇素酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：CSB-E17287r）、大鼠血栓調節蛋白ELISA試劑盒（批號：CSB-E17291r）購于武漢華美生物工程有限公司；其他所用試劑均為AR級分析純。

1.3實驗儀器EHK-40紅細胞沉降壓積儀（天津市亞坤電子科技發展有限公司）；F13168紅細胞變形聚集儀（北京飛斯富睿科技有限公司）；DMNNX-B型血小板聚集凝血因子分析儀（北京中科富邦醫療設備有限公司）；HF-3000血常規檢測儀（山東海力孚企業管理有限公司）；LG-R-80A全自動血液分析儀（北京中科富邦醫療設備有限公司）；LBYN6C全自動血液黏度儀（北京普利生儀器有限公司）；MVIS 2030全自動血流變分析儀（重慶天海科技有限公司）；SD34XN200細胞電泳儀（北京中西化玻儀器科技公司）；ELITIST 21K-R高速冷凍離心機（北京吉爾森科技有限公司）；多功能酶標儀（Perkin Elmer USA）。

1.4脈復生制備及動物分組和給藥按組方的配置，水煎1 h，過濾，再煎1次，合并續濾液，水浴濃縮，得到生藥濃度1 g/mL。SD大鼠60只，隨機分為空白對照組（10 mL/kg生理鹽水）、模型對照組（10 mL/kg生理鹽水）、陽性對照組（100 mg/kg阿司匹林）、脈復生高劑量組（劑量為10 g/kg）、脈復生中劑量組（劑量為5 g/kg）、脈復生低劑量組（劑量為2.5 g /kg），每組10只。口服灌胃給藥，連續給藥1周，每日給藥早晚各1次。

1.5大鼠急性血瘀證模型復制［2］皮下注射鹽酸腎上腺素注射液（0.8 mg/kg）2次，間隔4 h。首次注射2 h后，將大鼠置于0℃冰水浴5 min，復制急性血瘀模型，再次注射后禁食不禁水飼養。

1.6血小板聚集率、血漿P選擇素、大鼠血栓調節蛋白測定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打開腹腔，分離腸系膜，腹主動脈取血2 mL，用枸櫞酸鈉抗凝，在1 000 r/min下離心5 min，沉淀得富血小板血漿；再3 500 r/min下離心5 min，沉淀得貧血小板血漿，獲得血小板濃度為3.2×107/mL，用血小板凝聚誘導劑ADP（5 μmol/L），使用比濁法在37℃條件下測定1 min、5 min血小板聚集率以及5 min內血小板最大（Max）聚集率，計算血小板聚集抑制率（%）。血小板聚集抑制率=（模型組聚集率-用藥組聚集率）/模型組聚集率×100%。另取枸櫞酸鈉抗凝血1 mL，3 500 r/min離心15 min，吸取上層血漿，采用ELISA法測定血漿P選擇素和大鼠血栓調節蛋白。

1.7血液流變學、凝血功能、紅細胞沉降率、紅細胞壓積測定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打開腹腔，分離腸系膜，從腹主動脈取血，測APTT、TT、PT、全血黏度（WBV）、血漿黏度（PV）、纖維蛋白原（FIB）、紅細胞電泳時間、血小板電泳時間等血液流變學和凝血功能相關指標；以肝素鈉抗凝，取1.5 mL全血靜置于壓積管1h，記錄紅細胞沉降率，12 000 r/min離心10 min，記錄紅細胞壓積。

1.8血小板和紅細胞電泳時間測定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打開腹腔，分離腸系膜；從腹主動脈取血，肝素鈉抗凝；將抗凝血制成血漿紅細胞懸液，紅細胞數約為106～107/L，用瓊脂鹽橋（15 g/L瓊脂，100 g/L生理鹽水）與電極連接，采用40 V的直流電源，觀察單個紅細胞在網格測微型視野下連續往返跳動2格的時間為紅細胞電泳時間，自動記錄每個樣本500個數據的平均值。血小板電泳時，電壓為35 V，采用銀絲瓊脂電極，顯微鏡放大400倍，觀察血小板在血漿中往返2格的時間，每個樣本平均觀察10個樣本，取均值，記錄。

1.9統計方法采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，方差齊用t檢驗，方差不齊用t’檢驗，數據以均數±標準差（±s）表示，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組對急性血瘀大鼠APTT、TT、PT的影響表1結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組APTT、TT、PT顯著縮短（P＜0.01），提示造模成功；與模型對照組比較，脈復生高、中劑量組能顯著延長大鼠的APTT、TT、PT（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　各組對急性血瘀大鼠APTT、TT、PT的影響Table 1 Effect of Maifusheng on APTT，TT and PT of acute blood stasis model rats　（±s，t/s）

表1　各組對急性血瘀大鼠APTT、TT、PT的影響Table 1 Effect of Maifusheng on APTT，TT and PT of acute blood stasis model rats　（±s，t/s）

①P＜0.01，與空白對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組N 10 10 10 10 10 10 APTT 24.25±4.36 14.49±3.72①22.89±7.39 15.72±5.37 17.64±4.02②20.01±3.97③PT 19.65±4.07 13.39±3.71①17.59±3.25 14.05±3.19 14.92±3.51②16.74±3.23②TT 35.88±5.47 24.87±4.38①30.52±4.98 25.31±4.03 26.23±3.65②28.75±3.86③

2.2各組對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響表2結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組大鼠的全血切變率在在200、50、5 s-1下的全血黏度及血漿黏度顯著增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，脈復生高、中劑量組可顯著降低各切變率下的全血黏度（P＜0.05），脈復生高劑量組可降低血漿黏度（P＜0.05）。

2.3各組對急性血瘀大鼠纖維蛋白原含量和紅細胞壓積及沉降率的影響表3結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組大鼠的纖維蛋白原含量、紅細胞壓積及紅細胞沉降率顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，脈復生高、中劑量組可顯著降低纖維蛋白原含量、紅細胞壓積及紅細胞沉降率（P＜0.05或P＜0.01）。

2.4各組對急性血瘀大鼠血小板聚集率的影響

表4結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組大鼠的血小板聚集率顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，脈復生低、中、高劑量組均可顯著降低血小板聚集率（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組對急性血瘀大鼠WBV和PV的影響Table 2 Effect of Maifusheng on WBV and PV of acute blood stasis model rats　（±s）

表2　各組對急性血瘀大鼠WBV和PV的影響Table 2 Effect of Maifusheng on WBV and PV of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

組別　N　ηWBC/（mPa·s）　ηPV/（mPa·s）空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組10 10 10 10 10 10 5 s-118.25±3.34 30.35±4.96②23.22±3.21 27.95±3.93 25.46±4.26③23.97±4.15④50 s-16.23±1.14 9.77±1.32②5.36±1.25 8.80±1.08 6.15±1.37③5.97±1.41④200 s-13.21±0.43 4.84±0.75①3.81±0.62 4.47±0.67 4.25±0.79③4.03±0.72③1.32±0.39 1.79±0.471①1.41±0.51 1.81±0.42 1.73±0.25 1.55±0.3③

表3　各組對急性血瘀大鼠血漿纖維蛋白原和紅細胞壓積及沉降率的影響Table 3 Effects of Maifusheng on FIB，hematocrit and erythrocyte sedimentation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

表3　各組對急性血瘀大鼠血漿纖維蛋白原和紅細胞壓積及沉降率的影響Table 3 Effects of Maifusheng on FIB，hematocrit and erythrocyte sedimentation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組N 10 10 10 10 10 10 p纖維蛋白原/（g·L-1）2.73±0.26 7.45±0.92②4.63±0.51 7.29±0.73 5.96±0.92③5.02±0.75④V紅細胞沉降率/（mm·h-1）50.31±8.23 62.42±7.62①55.37±9.31 61.29±8.95 58.42±6.27③52.83±7.33④p紅細胞壓積/% 0.41±0.09 0.87±0.13②0.46±0.07 0.79±0.11③0.67±0.08④0.50±0.17④

表4　各組對急性血瘀大鼠血小板聚集率的影響Table 4 Effect of Maifusheng on platelet aggregation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

表4　各組對急性血瘀大鼠血小板聚集率的影響Table 4 Effect of Maifusheng on platelet aggregation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.01，與空白對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

組別　N　p血小板聚集率/%　p凝聚抑制率/%空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組10 10 10 10 10 10 1 min 18.82±3.63 35.24±7.81①23.73±3.19 31.49±5.21②27.46±4.96③24.21±4.32③5 min 18.64±3.14 37.54±6.31①6.32±3.36 35.90±5.72②26.92±5.25③24.63±4.91③Max 19.32±3.27 39.61±7.87①28.41±4.44 37.23±4.94②28.31±3.52③26.24±4.38③——28.27 6.01 28.53 33.75

2.5各組對急性血瘀模型大鼠紅細胞和血小板電泳時間的影響表5結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組大鼠的紅細胞電泳時間、血小板電泳時間顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型對照組比較，脈復生中、高劑量組可顯著降低紅細胞電泳時間、血小板電泳時間（P＜0.05或P＜0.01）。

表5　各組對急性血瘀大鼠紅細胞和血小板電泳時間的影響Table 5　Effect of Maifusheng on platelet and erythrocyte electrophoresis time of acute blood stasis model rats　（±s）

表5　各組對急性血瘀大鼠紅細胞和血小板電泳時間的影響Table 5　Effect of Maifusheng on platelet and erythrocyte electrophoresis time of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組N 10 10 10 10 10 10 t紅細胞電泳/s 16.21±3.55 28.49±6.14②17.27±3.43 23.28±4.33 20.36±4.25③16.84±4.11④t血小板電泳/s 23.75±5.12 35.59±5.87①25.29±6.33 30.13±5.44 28.89±6.12③24.46±5.47③

2.6各組對急性血瘀大鼠血漿P選擇素和血栓調節蛋白的調節作用表6結果顯示：模型對照組大鼠的血漿P選擇素和血栓調節蛋白的含量顯著高于空白對照組（P＜0.01）；脈復生中、高劑量組血漿P選擇素和血栓調節蛋白含量較模型對照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），且呈明顯的劑量依賴性，提示脈復生可通過介導血漿P選擇素和血栓調節蛋白改善急性血瘀大鼠血液流變性及凝血功能。

表6　各組大鼠血漿P選擇素和血栓調節蛋白的含量比較Table 6 Comparison of P-selectin and thrombomodulin contents in various groups　（±s）

表6　各組大鼠血漿P選擇素和血栓調節蛋白的含量比較Table 6 Comparison of P-selectin and thrombomodulin contents in various groups　（±s）

①P＜0.01，與空白對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組陽性對照組脈復生低劑量組脈復生中劑量組脈復生高劑量組N 10 10 10 10 10 10ρ血漿P選擇素/（μg·L-1）14.54±2.17 26.26±4.61①15.23±3.41 20.63±3.24 18.82±3.45②16.39±2.86③ρ血栓調節蛋白/（μg·L-1）7.42±2.07 12.25±3.71①10.85±2.64 12.25±3.28 11.28±2.65②9.55±1.86②

3　討論

經過40余年的臨床實踐，脈復生已證實具有行氣滋腎、養血活血、止痛散結等作用，對血栓性閉塞性脈管炎、動脈硬化閉塞癥及糖尿病足具有較好的治療效果［3-4］。研究［5］證實脈復生能較好地對抗二磷酸腺苷（ADP）誘導的血小板聚集作用，能非常顯著地縮短纖維蛋白溶解時間而不影響凝血時間，并能明顯地對抗實驗性血栓。患有脈管炎等血管性疾病的患者，在應激狀態下容易造成機體處于高凝狀態，最后形成血栓。因此，本研究選用了急性血瘀模型，該模型可以在短時間內評價脈復生能否較好地對抗ADP誘導的血小板聚集和對抗大鼠實驗性血栓的形成。

血栓閉塞的主要誘因是血管內皮細胞壞死脫落、紅細胞破裂或血小板的沉積、高血脂患者體內膽固醇在血管內壁的沉積，最終導致血管腔狹窄，血管韌性降低，從而引起血管栓塞［6］。纖維蛋白是血栓閉塞形成的骨架物質，研究［7-8］也證實血液流變性及凝血功能的異常是急性血瘀癥的重要病理表現，其主要影響因素是纖維蛋白升高引起分子間牽連增大了血液黏度，而橋聯作用又進一步增高紅細胞的聚集性，加重血液黏度。APTT、PT和TT是檢測內、外源性凝血和凝血共同通路變化的主要篩選指標，其中TT與纖維蛋白呈負相關，TT縮短纖維蛋白含量相應升高［9］。本研究結果提示脈復生通過降低血漿黏度、減少紅細胞聚集以及紅細胞壓積，減少血小板聚集，從而降低大鼠的全血黏度；促進纖維蛋白的溶解，延長活化部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和凝血酶時間。

血漿P選擇素是血小板或內皮細胞活化釋放產物之一，在血栓形成過程中起著扳機點的作用，血小板活化時被釋放于血漿中，介導活化血小板和內皮細胞、白細胞和內皮細胞之間的黏附，是血小板活化釋放的特異標志之一，可以作為血栓前狀態及血栓形成的標志性中間產物［10］；而血栓調節蛋白是一種廣泛分布于各種組織血管內皮細胞膜的單鏈糖蛋白，具有抗凝、抑制凝血酶、促進抗凝血酶滅活凝血酶等作用，作為凝血調節劑，它的存在不僅對凝血機制有重要的調節作用，還能降解纖溶酶原激活物抑制劑，增加血液中纖溶酶原激活物水平，促進纖維蛋白溶解［11-12］。本研究結果顯示：脈復生能降低血漿P選擇素和血栓調節蛋白含量，且呈一定的劑量依懶性，提示脈復生通過介導血漿P選擇素和血栓調節蛋白改善急性血瘀大鼠血液流變性及凝血功能。下一步將從其改善血液流變性及凝血功能的分子機制方面作深入研究，為闡明脈復生的藥效物質基礎及治療作用機制、提高用藥的安全性提供科學依據。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Maifusheng on Hemorheology and Blood Coagulation Function of Acute Blood Stasis Model Rats

LI Liming1，QI Yaoqun1，2，LI Arong1，3，LI Changqing4，GUO Jiewen1，LIU Ruoxuan1，DENG Zhijun1
（1.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130 Guangdong，China；
2.Graduate Candidate in 2014，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
3.Graduate Candidate in 2013，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
4.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Chinese Mdeicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Key words：Maifusheng；acute blood stasis model rats；hemorheology；blood coagulation function；

Abstract：Objective To study the effect of Chinese herbal medicine preparation Maifusheng on hemorheology and blood coagulation function of acute blood stasis model rats.Methods Sixty SD rats were randomly divided into blank group，model group，positive control group（100 mg/kg of asprine），and high-，middle- and low-dose Maifusheng groups（in the dosage of 10，5，2.5 g·kg-1·d-1，respectively）.Intragastric administration lasted for one week.After the last medication，acute blood stasis model was induced by injection of epinephrine plus ice bath.Hemorheology，blood coagulation function，platelet and erythrocyte electrophoresis time，and parameters of hemorheology and platelet in various groups were determined.Enzyme -linked immunosorbent assay（ELISA）was used for the detection of plasma P-selectin and thrombomodulin contents.

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0353 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．017

收稿日期：2015-10-19

作者簡介：李麗明（1975-），女，副主任中藥師；E-mail：ggchan911@163.com

通訊作者：郭潔文（1968-），女，主任藥師，博士研究生導師；E-mail：guo774@sina.com

基金項目：廣東省中醫管理藥局基金項目（編號：20151065、20141227）；廣州市中醫藥和中西醫結合科技項目（編號：20152A011011、20142A011012）