兩面針種子萌發(fā)的物理抑制因素探討

張振山，何瑞，詹若挺，盧識禮，唐立偉，邢建永

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州　510006；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳　518110）

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兩面針種子萌發(fā)的物理抑制因素探討

張振山1，何瑞1，詹若挺1，盧識禮1，唐立偉2，邢建永3

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳518110）

摘要：【目的】從物理因素的角度探討兩面針種子休眠的原因。【方法】通過種子吸水試驗檢查兩面針種子的吸水特性，采用掃描電子顯微鏡觀察種皮的顯微結(jié)構(gòu)，并比較層積處理對兩面針種皮的影響。【結(jié)果】兩面針的種皮透水性良好，無明顯吸水障礙；兩面針種子具有堅硬致密的種皮結(jié)構(gòu)，低溫層積處理可以降解、軟化其種皮結(jié)構(gòu)。【結(jié)論】兩面針種子中存在種子發(fā)芽的物理抑制因素，采用低溫濕沙層積處理可解除兩面針種子的萌發(fā)抑制作用。

關鍵詞：兩面針種子；種子休眠；物理抑制

藥材兩面針為蕓香科花椒屬植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC的干燥根，藥用價值廣泛，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，在痛癥方面具有十分獨特的療效［1］。兩面針是南方地區(qū)的大宗藥材，常用于中成藥三九胃泰顆粒、正骨水、消腫止痛酊等，藥材需求量較大，其野生資源已被過度采挖和破壞，造成藥材供應日漸短缺［2］，無法滿足臨床使用及中成藥生產(chǎn)投料的需要。

兩面針以種子繁殖為主，同屬的花椒、頂壇花椒、蜆殼花椒等植物種子均具有不同程度的復合休眠現(xiàn)象［3-5］，兩面針的繁殖培育相關研究也報道兩面針種子具有休眠現(xiàn)象［6-7］。種子休眠的一大重要原因是種皮的物理抑制作用［8］。本研究對兩面針種子進行掃描電子顯微鏡觀察，并對兩面針種子進行了吸水性檢查，從物理因素上探討兩面針種子休眠的原因，現(xiàn)報道如下。

1　材料

1.1儀器ZPZ-1000智能低溫低濕種子儲藏柜（杭州錢江儀器設備有限公司）；BCD-218SDA低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；MDF-U4086S超低溫冰箱（日本SANYO公司）；BS-224萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；BX41體視顯微鏡（日本Olympus公司）；LEO 1430VP掃描電子顯微鏡（德國里奧公司）。

1.2實驗材料兩面針果實采自廣西大塘的兩面針GAP基地，陰干至裂開后，去除枝梗、果皮，收集種子（批號：GX20130921），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為蕓香科花椒屬植物兩面針［Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.］的種子，千粒質(zhì)量為（24.82±0.26）g。加濕砂混勻，置于種子儲藏箱4℃儲藏備用。

2　方法和結(jié)果

2.1層積處理對兩面針種子發(fā)芽的影響對未進行低溫濕砂層積處理的兩面針種子和層積處理的兩面針種子的發(fā)芽試驗進行比較，探討低溫層積處理對兩面針種子發(fā)芽率的影響。發(fā)芽溫度為15℃，發(fā)芽床為砂上，光照。試驗采用完全隨機化設計，設3個重復，每個重復采用50粒種子。

表1結(jié)果顯示：兩面針種子隨著層積時間的增加，其發(fā)芽率漸漸提高，發(fā)芽起始時間縮短，提示兩面針種子存在休眠特性，低溫層積處理可提高兩面針種子的發(fā)芽率。

表1　兩面針種子隨層積時間增加的發(fā)芽情況Table 1 Germination rates of Zanthoxylum nitidum seeds increased with stratification time

2.2兩面針種子吸水性檢查按照不同處理方法，將種子分組為未處理（從果實中直接剝?nèi)》N子）、損傷種皮處理（用小剪剪去約1 mm2的小口），每個處理設置3個重復，每個重復為10粒種子。將種子表面擦拭干凈后，稱定6份種子的質(zhì)量，置于培養(yǎng)皿中加入3 mL純水，在種子吸脹1、2、3、4、5、8、12、20、24、28、32、44、48 h后吸干表面水分，稱定種子質(zhì)量。

計算種子吸水率：p吸水率（%）=（m吸脹后-m吸脹前）/ m吸脹前×100%。繪制不同處理的兩面針種子隨時間變化的吸水曲線。

圖1結(jié)果顯示：損傷種皮的兩面針種子吸水迅速，在24 h之后趨于恒定質(zhì)量；未處理種子吸水較緩慢，但兩者逐漸趨近，至第20 h時已無顯著性差異。表明兩面針種子的吸水作用良好，并不存在明顯的吸水阻滯作用，兩面針種子的透水性不是種子發(fā)芽率低、周期長的主要原因。

圖1　不同處理兩面針種子48 h內(nèi)吸水情況（?±s，N=3）Figure 1 Zanthoxylum nitidum seed water-absorption curves within 48 h after treatment with different methods

2.3兩面針種子外部形態(tài)及種皮電鏡觀察

2.3.1兩面針種子性狀特點圖2結(jié)果顯示：兩面針果實為蓇葖果，圓球形，外果皮青綠色或紫紅色，裂開時露出黑色光亮種子，有時可見為灰白色的內(nèi)果皮包被（圖2-a）。種子卵圓狀至圓球狀，外部包被一層黑色光亮的蠟質(zhì)，底端具有凹陷的種臍（圖2-b、c），磨去蠟質(zhì)后顯堅硬的角質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖2-d），沿腹縫線剖開可見內(nèi)部點狀的胚根和橢圓形子葉（圖2-f）。聞之具強烈的花椒氣味，味苦辣。

2.3.2兩面針種子掃描電鏡觀察取兩面針種子，一部分直接剖開種皮，觀察種子外表面、剖面和內(nèi)壁，另一部分種子于4℃濕砂層積3個月后取出。將兩面針種子剖開，放入臨界點干燥儀中充分干燥，分外表面、剖面和內(nèi)表面進行處理后，把樣品臺放在離子濺射儀中鍍膜，然后把樣品置掃描電鏡中觀察并拍照。選擇合適的電鏡倍數(shù)，觀察兩面針種子表面、剖面和內(nèi)壁的微觀結(jié)構(gòu)。2.3.2.1外種皮如圖3、圖4所示，在掃描電鏡下，兩面針種子外被一層薄而致密的蠟質(zhì)，蠟質(zhì)破裂處，可觀察到位于下層的外種皮結(jié)構(gòu)，外種皮呈孔隙狀結(jié)構(gòu)，細胞大而明顯，排列疏松，呈長橢圓形。

圖2　兩面針果實和種子Figure 2 Fruits and seeds of Zanthoxylum nitidum

觀察未層積和層積后的種子掃描圖，圖4結(jié)果顯示：兩面針種子表面由光滑而致密的蠟質(zhì)覆蓋，隱約可見下層外種皮結(jié)構(gòu)形成的突起。蠟質(zhì)易破損，露出外種皮（腔隙狀）。與未層積處理種子的種皮比較，層積后的兩面針種子種皮蠟質(zhì)破損較嚴重，蠟質(zhì)和外種皮間顯現(xiàn)空隙，結(jié)合松散，突起不明顯，露出的外種皮降解程度較高。即層積處理對兩面針種子外種皮具有降解、軟化作用。

圖3　兩面針種子橫斷面掃描電鏡圖（×150）Figure 3 Scanning electron microscopic image of cross-section of Zanthoxylum nitidum seeds

圖4　兩面針種子表面掃描電鏡圖（層積前后）Figure 4 Scanning electron microscopic images of Zanthoxylum nitidum seed surface before and after stratification

2.3.2.2中種皮兩面針種子種皮的斷面主要為蠟質(zhì)、外種皮和中種皮3層結(jié)構(gòu)，其中，中種皮為硬角質(zhì)，細胞排列緊密，看不到細胞腔，占種皮厚度的一半以上，是兩面針種子種皮的主體結(jié)構(gòu)，也是造成兩面針種子硬實性的主要原因。這種結(jié)構(gòu)對胚起保護作用，但在種子萌發(fā)期對種胚的生長、伸長造成了機械阻力。

圖5結(jié)果顯示低溫層積處理和未處理的兩面針種子種皮情況：層積處理后，中種皮組織分解、脫落，留下疏松、多孔的骨架結(jié)構(gòu)，這可解釋兩面針種子在低溫層積處理后期，種皮能自行裂開、脫落的現(xiàn)象。表1結(jié)果顯示：低溫層積處理后兩面針種子的萌發(fā)時間縮短，發(fā)芽率提高。

2.3.2.3種皮內(nèi)壁圖6結(jié)果顯示：種皮與種胚之間連接處有一層膜狀結(jié)構(gòu)，為兩面針種子的附屬結(jié)構(gòu)，在其他花椒屬植物種子中也有發(fā)現(xiàn)［9］，但其具體功能未知。比較層積處理及未處理的兩面針種子，提示層積處理對種子的內(nèi)壁影響較小。

圖5　兩面針種子橫斷面掃描電鏡圖（層積前后）Figure 5 Scanning electron microscopic images of Zanthoxylum nitidum seed cross-section before and after stratification

圖6　兩面針種子內(nèi)壁掃描電鏡圖Figure 6 Scanning electron microscopic images of Zanthoxylum nitidum seed inwall before and after stratification

3　討論

在許多高等植物如禾本科、蕓香科植物中，表皮細胞外常覆蓋一層角質(zhì)層蠟質(zhì)，具有一定的生理和生態(tài)功能，如阻止植物非氣孔性失水，也可引起植物種子的硬實透水透氣性差，對胚的生長造成機械性束縛，引起種子休眠［10-11］。

但在兩面針種子的吸脹實驗中發(fā)現(xiàn)，兩面針種皮并不存在明顯的吸水阻滯作用。進一步對種子的顯微結(jié)構(gòu)進行觀察，兩面針種子主要由外種皮、中種皮和內(nèi)種皮組成，其中外種皮包被一層致密而薄的蠟質(zhì)和一層柵欄狀的表皮細胞，吸水性實驗表明兩面針種子的這種結(jié)構(gòu)可以保證種子吸水的正常進行，這和花椒屬另一植物蜆殼花椒的種子吸水性質(zhì)基本一致［3］。

兩面針種子中種皮占兩面針種皮厚度的一半以上，細胞排列緊密，細胞間隙不明顯，是造成兩面針種子物理硬實的主要原因。比較未處理和層積處理的兩面針種子結(jié)果顯示：通過濕砂以及低溫處理，可軟化兩面針種子的種皮結(jié)構(gòu)，使得種皮硬實結(jié)構(gòu)變疏松，中種皮細胞脫落。在實驗中也發(fā)現(xiàn)，層積處理末期，兩面針種子的種殼甚至出現(xiàn)自行裂開，露出內(nèi)部種胚的現(xiàn)象。

花椒屬多種植物種子均具有硬實性強的特性，針對這種特性，許多研究者提出采用磨損種皮、酸蝕、堿蝕等方法對種子進行處理，但由于在種子的批量處理時方法較繁瑣，且不易掌控處理程度，極易損傷種子活力［12-14］。而通過層積處理可模擬冬季的低溫過程，軟化種皮，同時促進種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素的積累，解除種子休眠，提高種子發(fā)芽率［4］，對種子損傷小，在實際生產(chǎn)中較常用。本研究通過采用低溫濕砂層積處理兩面針種子，可顯著地提高發(fā)芽率。然而，處理所需時間較長（3個月以上）則是限制層積處理的一個重要因素。為進一步提高兩面針種子的繁殖效率，從外源激素、內(nèi)源激素、代謝營養(yǎng)物質(zhì)等方面研究種子的休眠生理，也成為種子破除休眠工作的一個重要研究點［15-16］。

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【責任編輯：黃玲】

Investigation of Physical Factors of Inhibiting Germination of Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC Seeds

ZHANG Zhenshan1，HE Rui1，ZHAN Ruoting1，LU Shili1，TANG Liwei2，XING Jianyong3
（1.Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Key Laboratoryof Chinese Medicinal Resources from Lingnan，Ministryof Education Joint Laboratoryof National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines，Guangzhou Universityof Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
2.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou Universityof Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
3.China Resources Sanjiu Medical &Pharmaceutical Co.Ltd，Shenzhen 518110 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the physical mechanism of dormancy of Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC seeds.Methods Water-absorbtion characteristics of Zanthoxylum nitidum seeds were tested by permeability experiments.Scanning electron microscope was used to observe the microstructure of Zanthoxylum nitidum seed testa，and the structure of seed testa before and after stratification were compared.Results Good permeability of Zanthoxylum nitidum seed testa ensured water absorption of the seeds.Zanthoxylum nitidum seeds contained hard and dense testa structure，but low temperature stratification degraded and softened the testa.Conclusion Physical factors of inhibiting Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC seed germination can be degraded by low temperature stratification.

Keywords：Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC seeds；seed dormancy；physical inhibition

中圖分類號：R282.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0411 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．028

收稿日期：2015-12-18

作者簡介：張振山（1990-），男，碩士研究生；E- mail：zhenshan_cham@163.com

通訊作者：何瑞，女，博士，研究員，博士研究生導師；E- mail：ruihe@gzucm.edu.cn

基金項目：廣東省協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新科研團隊建設項目（編號：A1- AFD01514A04）