腭胚突發育過程中survivin蛋白的差異性表達及意義

柯昌能，方景玲，李維珊，鄒松云

深圳市龍華新區中心醫院燒傷整形科，廣東 深圳 518100

·基礎研究·

腭胚突發育過程中survivin蛋白的差異性表達及意義

柯昌能，方景玲，李維珊，鄒松云

深圳市龍華新區中心醫院燒傷整形科，廣東 深圳 518100

目的 探討腭胚突發育過程中survivin蛋白的表達。方法 取孕第13.5天、14.5天、15.5天近交系C57BL/6 J鼠胚；免疫組織化學和Western blot 檢測survivin蛋白的表達。結果 survivin蛋白主要表達于腭胚突周皮細胞；孕第13.5天的表達強度明顯高于孕第14.5天、15.5天。結論 survivin的表達在腭胚的發育過程中存在差異性；這種差異性可能對維持腭胚的生長和融合起重要作用。

Survivin；腭；發育；胚胎

腭胚的發育大致分為三個階段：兩側上頜生長弓處腭原基的誘導生成并沿舌側邊緣垂直向下生長；兩側腭板相對上抬致水平位置并向中線靠攏；兩側腭板的黏附、腭中脊上皮的形成和消失[1]。此過程涉及組織細胞的遷移、生長、分化、凋亡以及細胞外基質分子的合成和信號通路分子等的協同作用。上述環節受到干擾，將導致腭裂的發生。研究發現，survivin在細胞的分裂、遷移、生存中起重要作用,與胚胎早期的正常發育有關。本文研究鼠腭胚的不同發育階段survivin的表達情況，探討其在腭胚正常發育中的作用。

1 材 料 和 方 法

1.1 標本的獲取

1.1.1 實驗動物飼養、觀察 8周齡近交系C57BL/6 J小鼠飼養于SPF級動物房, 雌雄比例1∶1 配對，晚6時至次日6時合籠, 次晨檢查雌鼠, 有陰道粘液栓者為交配陽性,, 定此日胎齡為0.5天(E0.5)。

1.1.2 標本取材 取妊娠第13.5(E13.5)、14.5(E14.5)、15.5(E15.5)天母鼠，以頸椎脫位方式處死, 剖腹取出胎鼠。部分胎鼠放入4 %的多聚甲醛液中，4℃過夜固定，備作石蠟切片。部分胎鼠在解剖顯微鏡下取出腭胚突，放液氮罐中凍成備用。

1.2 試 劑

survivin蛋白抗體(兔抗鼠，Sigma公司)、全蛋白提取試劑盒(Sigma公司)、β-actin抗體(Sigma公司)、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術公司)。

1.3 免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟,后按說明書操作；光鏡下細胞呈棕色為陽性。

1.4 Western blot 檢測按常規操作，包括提取總蛋白、電泳、轉印、雜交、洗膜、染色。survivin抗體1:200稀釋和β-actin抗體1:1000稀釋。凝膠圖像分析系統掃描分析，以相對灰度值代表蛋白表達量。

1.5 統計學分析采用SPSS 18.0統計軟件，兩組間比較用檢驗，多組間比較方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Survivin 在腭胚組織中的免疫組織化學染色

鼠胚13.5天，兩側腭胚突組織沿舌側垂直生長；survivin主要表達于腭胚突周皮層細胞的胞漿，間充質細胞無表達。鼠胚14.5天，兩側腭胚突組織上抬，黏附；中間形成上皮嵴，腭突未融合；腭胚突周皮層細胞和中間上皮嵴細胞survivin表達減弱；鼠胚15.5天，兩側腭胚突組織融合，中間上皮帶消失，腭胚周皮層細胞survivin少許表達(圖1)。圖1. 小鼠胚胎13.5，14.5，15.5天腭突上皮survivin的表達(p 腭突，t 舌)

2.2 腭胚組織中survivin蛋白Western blot 檢測Western blot 檢測發現，鼠胚13.5、14.5、15.5天，腭胚突組織survivin蛋白表達的灰度比值分別為（0.85±0.12）、（0.42±0.24）、（0.34±15）；15鼠胚E13.5腭突組織survivin蛋白表達的明顯強于E14.5及E15.5（15.5P＜0.01）0.01

3 討 論

Survivin 是一種凋亡抑制蛋白家,主要表達于腫瘤組織、造血干細胞、胚胎發育組織、分泌期子宮內膜等組織；大多數人類終末分化成熟的成體組織少有表達。它與細胞分裂、增殖等功能密切相關。正常情況下，survivin在維持人類早期胚胎及胸腺的發育中起重要作用[2][2]。

腭胚的正常發育涉及兩個重要環節：兩側腭胚的正常生長及融合；該過程與細胞的增殖、遷移、凋亡有關；某一環節發生障礙，將導致腭裂的發生[3][3]。本研究發現，腭胚發育的早期，survivin主要表達于腭胚周皮層細胞，強度較高；可能與survivin維持vin腭胚早期生長，抑制周皮層細胞的凋亡有關。在幾個基因敲除的動物模型中發現，腭裂的發生與腭胚同口腔組織黏連，限制腭胚突的上抬有關；其發生機理涉及腭胚周皮層細胞的過多、過早凋亡[4,5][4,5]。Survivinvivin維持胚胎的正常發育與其抑制細胞凋亡、促進細胞分裂有關；IRF6等基因敲除動物所發生的腭裂模型是否與survivin的表達下調，導致細胞凋亡、極性改變，促進腭胚同口腔組織的不正常融合有關，有待進一步深入研究。

本研究還發現，隨著腭胚的發育，survivin的表達下降。在胚胎14.5天，兩側腭胚接觸，形成中間上皮嵴；免疫組織化學檢測發現上皮嵴細胞survivinvivin的表達明顯下降。中間上皮嵴的消失是腭胚正常發育的關鍵一環。許多研究發現，細胞凋亡在腭胚中間上皮嵴消失中起重要作用；抑制細胞凋亡，將導致腭裂的融合障礙[6,7][6,7]。因此，腭胚的發育后期，survivinvivin的表達下降，有利于抑制上皮嵴細胞的增殖，促進凋亡，引導腭胚的融合。

總之，survivin的表達在腭胚的發育過程中存在差異性；這種差異性可能對維持腭胚的生長和融合起重要作用；survivin在腭胚發育過程中的差異性表達可能受相關基因調控，具體研究有待進一步深入。

[1] Greene RM, Pisano MM. Palate morphogenesis: current understanding and future directions[J]. Birth defects research Part C, Embryo today : reviews. 2010;90(2):133-154.

[2] Fukuda S, Pelus LM. Regulation of the inhibitor-

[2 of-apoptosis family member survivin in normal cord blood and bone marrow CD34(+) cells by hematopoietic growth factors: implication of survivin expression in normal hematopoiesis[J]. Blood. 2001;98(7):2091-2100.

[3] Chai Y, Maxson RE, Jr. Recent advances in craniofacial morphogenesis[J]. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 2006;235(9):2353-2375.2375.

[4] Richardson RJ, Dixon J, Jiang R, et al. Integration of IRF6 and Jagged2 signalling is essential for controlling palatal adhesion and fusion competence[J]. Human molecular genetics. 2009;18(14):2632-2642.2642.

[5] Xiong W, He F, Morikawa Y, et al. Hand2 is required in the epithelium for palatogenesis in mice[J]. Developmental biology. 2009;330(1):131-141.-141.

[6] Iseki S. Disintegration of the medial epithelial seam: is cell death important in palatogenesis[J]? Development, growth & differentiation. 2011;53(2):259-268.

[7] Holtgrave EA, Stoltenburg-Didinger G. Apoptotic

[ epithelial cell death: a prerequisite for palatal fusion. An in vivo study in rabbits[J]. Journal of cranio-maxillo-facial surgery : official publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 2002;30(6):329-336.-336.

廣東省醫學科學技術研究基金：WSTJJ2012122420205197207095717】

柯昌能，男，1972，博士，副主任醫師。