補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量測(cè)定

王紫燕，李春沁，董佳悅，劉美琳，張梅，謝學(xué)軍

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補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量測(cè)定

王紫燕1，李春沁1，董佳悅1，劉美琳1，張梅1，謝學(xué)軍2

［摘要］目的：建立補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量測(cè)定方法。方法：以人參皂苷Re為對(duì)照品，香草醛-高氯酸顯色，采用分光光度法于544 nm處測(cè)定補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷的含量。結(jié)果：在50.1～150.3 μg范圍內(nèi)，對(duì)照品Re的吸光度與含量線性關(guān)系良好（r=0.9996），平均回收率為99.95%，RSD=2.33% （n=6）。結(jié)論：該法精密度、重現(xiàn)性良好，可作為補(bǔ)腎活血方人參總皂苷的含量測(cè)定方法。

［關(guān)鍵詞］補(bǔ)腎活血方；人參總皂苷；含量測(cè)定；分光光度法

［作者單位］1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075

Tel:18384257028 Email:462207970@qq.com

Tel:（028）61800231 Email:zhangmei63@126.com謝學(xué)軍（1963-），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治眼底病的基礎(chǔ)與臨床研究Tel:（028）87767332 Email:xxj8848@163.com

補(bǔ)腎活血方由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科謝學(xué)軍教授等研制而成，由地黃、丹參、人參、葛根等中藥配伍組成［1］，對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retiaopathy， DR）有良好的防治作用［2，3］。課題組前期研究［4，5］表明補(bǔ)腎活血方組方藥材之一人參通過藥物干預(yù)途徑發(fā)揮防治DR的作用，其中人參皂苷是其主要活性成分。因此，本研究擬建立分光光度法測(cè)定補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量的方法，為補(bǔ)腎活血方質(zhì)量控制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與試藥

TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BT 125D型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

人參皂苷Re對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-13041201，含量99.5%）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，藥材地黃、丹參、人參、葛根購自成都市荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定分別為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥塊根、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根、五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey. 的干燥細(xì)支根或須根、豆科植物甘葛藤粉葛Pueraria thomsonii Benth.的干燥根。

2　方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Re對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品溶液（1.002 mg.mL-1）。

2.1.2 供試品溶液的制備［6］取補(bǔ)腎活血方粉末1 g，精密稱定，加10 mL 水超聲處理20 min，加10 mL乙醚脫脂兩次，取水層加水飽和正丁醇溶液萃取5次，每次10 mL，收集正丁醇液，加2倍氨試液洗滌2次，再用正丁醇飽和的水溶液洗滌3次，每次50 mL。揮干正丁醇并用甲醇定容至10 mL，即得供試品溶液。2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺人參的陰性復(fù)方粉末按2.1.2項(xiàng)下操作，制得陰性對(duì)照溶液。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

取對(duì)照品溶液130 μL、供試品溶液400 μL和陰性對(duì)照溶液400 μL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，水浴揮干甲醇，冷卻，準(zhǔn)確加入5%香草醛冰乙酸溶液0.2 mL，再加入0.8 mL高氯酸，混勻后于60 ℃水浴上加熱15 min，取出，迅速冰水浴冷卻2 min后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5 mL，搖勻，隨行試劑作平行空白對(duì)照，于紫外-可見光分光光度計(jì)在400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，掃描圖譜見圖1。由圖1可見，供試品溶液與對(duì)照品溶液在544 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，陰性對(duì)照溶液在該處無吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為544 nm。

圖1 光譜掃描圖（a.樣品 b.對(duì)照品 c.陰性對(duì)照）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取人參皂苷Re對(duì)照品溶液50、70、90、110、130、150 μL于10 mL具塞刻度試管中，水浴揮干甲醇，冷卻，準(zhǔn)確加入5%香草醛冰乙酸溶液0.2 mL，再加入0.8 mL高氯酸，混勻后于60 ℃水浴上加熱15 min，取出，迅速冰浴冷卻2 min后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5 mL，搖勻，隨行試劑作平行空白對(duì)照，按分光光度法，在544 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸光度為縱坐標(biāo)，人參皂苷Re含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=0.0047X-0.0261，r=0.9996，人參皂苷Re在50.1μg～150.3 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取110 μL人參皂苷Re對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，其吸光度值的RSD=0.26%，表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取300 μL供試品溶液，按2.3項(xiàng)下方法分別于0、5、10、15、20、25、30 min，測(cè)定其吸光度，RSD=2.97%，結(jié)果表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方粉末約1g，共6份，按2.1.2項(xiàng)下制備供試品溶液，精密移取300 μL于10 mL具塞刻度試管中，按“2.3”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，平均含量為4.3202 mg.g-1， RSD=2.50%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的補(bǔ)腎活血方粉末6份，每份0.5 g，分別精密加入含有人參皂苷Re對(duì)照品（6.732 μg.mL-1）的水溶液10 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密移取300 μL于10 mL具塞刻度試管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。計(jì)算得到人參皂苷Re的平均回收率為99.95%，RSD=2.33% （n=6），結(jié)果見表1。

表1 人參皂苷Re加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批補(bǔ)腎活血方樣品（樣品來源見表2），按2.1.2項(xiàng)下制備供試品溶液，精密移取300 μL于10 mL具塞刻度試管中，按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表2 3批補(bǔ)腎活血方來源

表3 3批補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3　討論

補(bǔ)腎活血方成分復(fù)雜，主要有環(huán)烯醚萜類、酚酸類、異黃酮類及人參皂苷類。為了減小干擾保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，我們對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了研究。首先采用乙醚除去脂溶性成分；隨后采用正丁醇萃取人參總皂苷，并對(duì)萃取次數(shù)進(jìn)行考察，確定萃取5次能萃取完全；然后用氨試液洗滌正丁醇收集液，以除去酚酸類、黃酮類等成分的干擾；最后用正丁醇飽和的水溶液洗滌正丁醇液3次，使溶液呈中性。人參總皂苷的測(cè)定采用香草醛-高氯酸比色法，結(jié)果表明所建立的方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，為補(bǔ)腎活血方質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ)。

試驗(yàn)測(cè)定的3批補(bǔ)腎活血方由不同產(chǎn)地的單味藥材隨機(jī)組合，測(cè)定結(jié)果表明含吉林產(chǎn)人參的補(bǔ)腎活血方中人參總皂苷含量最高，其次是遼寧產(chǎn)人參，產(chǎn)自黑龍江的人參其總皂苷含量最低（4.303＞3.992＞3.320 mg.g-1）。

［參考文獻(xiàn)］

［1］謝學(xué)軍，張梅，王明芳.一種中藥組合物及其制備方法:中國，200910308470.3［P］. 2010-03-03.

［2］馬殿偉，謝學(xué)軍，張梅，等.補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)高糖和（或）缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力及谷氨酰胺合成酶活性的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2014，34（6）:510.

［3］馬殿偉，謝學(xué)軍，張梅，等.補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)高糖和（或）缺氧狀態(tài)下共同培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和Müller細(xì)胞谷氨酸代謝的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2015，35（5）: 5419.

［4］姚紅娥，張梅，徐秒，等.人參皂苷提取物對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2014， 25（5）: 1025.

［5］姚紅娥，張梅，徐秒，等.人參皂苷對(duì)糖基化終末產(chǎn)物條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活力的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014，20（9）:157.

［6］姚紅娥，張梅，徐秒，等.人參須根中皂苷類成分提取工藝的研究［J］.中藥與臨床， 2014， 5（2）: 35.

（責(zé)任編輯：李蕓霞）

Determination of ginsenosides content in Bushen Huoxue prescription

WANG Zi-yan1， LI Chun-qin1， DONG Jia-yue1，LIU Mei-lin1， ZHANG Mei1， XIE Xue-jun2//（1. School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education， State Key Laboratory Breeding Base of Systematic research， development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， China； 2. School of Clinical Medicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China）

［Abstract］Objective: To establish a method for the content determination of ginsenosides in Bushen Huoxue prescription. Method: With ginsenoside Re as reference substance， the content of ginsenosides in Bushen Huoxue prescription was determined by spectrophotometry after HClO4-vanilin staining. Result: The calibration curve of ginsenoside Re was linear in the range of 50.1μg ～150.3 μg. The average recovery was 99.95% and RSD was 2.33% （n=6）. Conclusion: This method can be used for the quality control of Bushen Huoxue prescription with good precision and reproducibility.

［Key words］Bushen Huoxue prescription； ginsenosides； content determination； spectrophotometry

［中圖分類號(hào)］R 284.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-013-03

［基金項(xiàng)目］國 家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072845；81473735）

［作者簡(jiǎn)介］王 紫燕（1991-），女，碩士在讀，研究方向?yàn)橹兴幱行С煞址治鲅芯?/p>

［通訊作者］張梅（1963-），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究工作

［收稿日期］2015-09-25