HPLC同時測定地榆升白片中沒食子酸和（+）-兒茶素的含量

胡佳，王澤宇，廣兵，康敏，李鴻翔，鄧赟

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HPLC同時測定地榆升白片中沒食子酸和（+）-兒茶素的含量

胡佳1，王澤宇1，廣兵2，康敏1，李鴻翔1，鄧赟1

［摘要］目的：建立HPLC同時測定地榆升白片制劑中沒食子酸和（+）-兒茶素的含量方法。方法：采用Inertsil ODS-3色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.），以甲醇-0.05%磷酸為流動相，梯度洗脫；檢測波長280 nm；體積流量1 mL.min-1；柱溫30 ℃。結果：沒食子酸和（+）-兒茶素的線性范圍分別為20.82～187.38 μg.mL-1（r=0.9996）、20.90～188.10 μg.mL-1（r=0.9998），平均加樣回收率分別為98.99%（RSD=1.88%）和101.09%（RSD =0.58%）。結論：該方法操作簡便、靈敏、準確，可作為地榆升白片的質量控制方法。

［關鍵詞］地榆升白片；沒食子酸；（+）-兒茶素；高效液相色譜法；含量測定

［作者單位］1. 成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137；2.成都地奧制藥集團有限公司，成都 610041

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赟，男，研究員，博士生導師，主要從事中藥化學成分與質量標準化研究

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地榆升白片是由地榆單味藥加工制成的片劑，具有升高白細胞的作用，用于白細胞減少癥［1］。臨床上常作為化療期間的輔助用藥［2］，也可用于治療精神病藥所致的白細胞減少癥［3］、干擾素治療乙型肝炎所致的白細胞減少癥［4］。處方中地榆是薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆Sanguisorba officinalis L.Var. longifolia（Bert.）Yü et Li的干燥根，具有涼血止血，解毒斂瘡的功效［5］。地榆中主要含有多酚類、皂苷類和黃酮等化學成分，多酚類成分主要有沒食子酸、（+）-兒茶素、鞣花酸、沒食子兒茶素等［6-8］。2010版《中華人民共和國藥典》中地榆藥材含量測定項下對沒食子酸含量進行了測定。地榆升白片未收錄于2010版《中華人民共和國藥典》；地榆升白片現有標準收錄于《國家中成藥標準匯編》，在含量測定項下為采用高效液相色譜法對沒食子酸進行含量測定［1］。

現代藥理學表明，地榆中所含的沒食子酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射和抗病原微生物等廣泛的藥理作用［9］；此外地榆中所含另一主要活性成分兒茶素也具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等作用［10］，Takano等［11］研究表明兒茶素對5-氟二氧嘧啶引起的小鼠骨髓抑制所造成的血液毒性有極強的藥理作用，能促進其白細胞和血小板數量的恢復和增長，同時提高脾臟指數，具有促進骨髓細胞增殖的作用。石衛民等［12］研究證明兒茶素具有降低輻射對造血組織的損傷，促進造血功能恢復的作用。兒茶素是升高白細胞的確切活性成分，而現有的地榆升白片的含量測定指標僅對沒食子酸進行測定。為有效的控制產品質量，本實驗首次建立了高效液相色譜法同時測定地榆升白片中沒食子酸和兒茶素的含量，該法簡便、靈敏、準確，為進一步完善地榆升白片的質量評價體系提供了科學方法和依據。

1　儀器、試藥與藥品

SSI series 1500高效液相色譜儀（紫外檢測器、CSChrom Plus色譜工作站、美國SSI公司）；色譜柱Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm，GL Sciences lnc.）； KQ-600DE型數控超聲波清洗器（40 KHz，600 W，昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（瑞士奧豪斯DV-215-CD）；優普UPT系列超純水器（成都優普電子產品有限公司）。

地榆升白片（批號141215、141111、140811、141208，由成都地奧制藥集團有限公司提供）；沒食子酸對照品（批號：11083-201204，購于中國藥品生物制品鑒定所），（+）-兒茶素對照品（批號：110877-201203，購于中國藥品生物制品鑒定所）。液相用甲醇為色譜級（美國J.T.Baker），水為超純水，其余試劑為市售分析級。

2　方法與結果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；GL Sciences Inc.）；流動相為甲醇-0.05%磷酸，梯度洗脫（0～18 min，5%～14%；18～50 min，14%～21%；50～53 min，21%～55%；53～55 min，55%～5%；55～65 min，5%）；檢測波長280 nm；體積流量1 mL.min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。理論塔板數分別按沒食子酸和（+）-兒茶素峰計算均應不低于20000。在此色譜條件下，沒食子酸和（+）-兒茶素均與樣品中其他組分色譜峰達到基線分離，分離度均大于1.5，見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取沒食子酸、（+）-兒茶素對照品適量，置同一量瓶中，5%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備溶液，分別為沒食子酸1.041 mg.mL-1、（+）-兒茶素1.045 mg.mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

取地榆升白片（批號：141215）40片，除去包衣，精密稱定，研細，取約3.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖1 對照品及制劑的HPLC圖（1.沒食子酸；2. （+）-兒茶素）

2.4 線性關系

檢測限和定量限 分別精密吸取“2.2”項下制備的混合對照品貯備溶液適量，加5%甲醇稀釋，分別配制成含沒食子酸對照品20.82、41.64、83.28、104.10、166.56、187.38 μg.mL-1，含（+）-兒茶素對照品20.90、41.80、83.60、104.50、167.20、188.10 μg .mL-1的混合對照品溶液，在“2.1”項下色譜條件下平行3次測定峰面積，以質量濃度X（μg.mL-1）為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，進行線性回歸，得混合對照品的標準曲線和各對照品回歸方程。將對照品溶液用甲醇不斷進行稀釋后分析，分別得到沒食子酸和（+）-兒茶素的檢測限LOD值（S/N≈3）和定量限LOQ值（S/N≈10）。目標化合物的回歸方程、相關系數（r）、線性范圍、檢測限和定量限見表1。結果表明，沒食子酸和（+）-兒茶素在線性范圍內濃度與峰面積線性關系良好，方法靈敏度高。

表1 地榆升白片中沒食子酸和（+）-兒茶素的線性關系（n=3）

2.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液20 μL，重復進樣6次，記錄峰面積，結果顯示，沒食子酸和（+）-兒茶素的峰面積RSD值分別為1.19%、1.44%，說明方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取本品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12、24、48 h照“2.1”項下色譜條件測定，由峰面積計算穩定性，沒食子酸和（+）-兒茶素的RSD分別為1.36%、1.64%。結果表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

稱取同一批地榆升白片（批號：141215）6份，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，將測定沒食子酸和（+）-兒茶素的峰面積代人“2.5”項下的回歸方程，計算。結果顯示，沒食子酸和（+）-兒茶素的RSD分別為1.06%、1.21%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：141215）共6份各約1.8 g，加入1.2 mL的含沒食子酸對照品1.046 mg.mL-1、含（+）-兒茶素對照品1.045 mg.mL-1的對照品溶液，照2.3項下制備，按2.1項色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表2。結果表明，沒食子酸平均回收率98.99%，RSD為1.88%；（+）-兒茶素平均回收率為101.09%，RSD為0.58%。

表2 沒食子酸、（+）-兒茶素的加樣回收率（n=6）

2.9 含量測定

取4批地榆升白片制劑，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，每批樣品平行測定3次，取平均值計算每片地榆升白片的含量，結果見表3。

表3 地榆升白片含量測定結果（n=3）

3　討論

由于本制劑僅含一味藥材，且為原粉入藥，預實驗發現制劑賦形劑不影響測定，所以供試品溶液的制備考慮采用中成藥標準中地榆升白片供試品溶液的制備工藝［1］。

本研究經DAD全波長掃描，（+）-兒茶素除末端吸收外，還有一強吸收帶，對應的λ值為280 nm+，與此同時，沒食子酸在此條件下也有較好的吸收，故選擇280 nm作為同時測定兩種成分的檢測波長。預實驗結果表明HPLC采用等度洗脫的分離效果不理想，故采用梯度洗脫。沒食子酸、（+）-兒茶素峰計算理論塔板數均大于20000，沒食子酸和（+）-兒茶素與其它雜質峰達到基線分離，分離度大于1.5，可滿足定量要求；按此色譜條件選三根不同色譜柱（Inertsil ODS-3，250 mm×4.6 mm；Alltima C18，4.6 mm×250 mm；Kromasil C18，200 mm×4.6 mm）分別測定理論塔板數，結果表明Inertsil ODS-3色譜柱的分離效果較好。分別對2個對照品的檢測限和定量限進行測定，結果顯示沒食子酸和（+）-兒茶素線性范圍的下限和測定樣品中的量均遠高于此定量限，說明此分析方法合理，具有靈敏的定量檢測能力。

本文采用高效液相色譜法操作簡便，重現性好，能有效控制質量，可作為地榆升白片內控標準的測定方法。

參考文獻

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［12］石衛民，趙新萍，蘆婷.兒茶素對小鼠的輻射防護作用［J］.南方醫科大學學報，2006，26（11）:1621.

（責任編輯：李蕓霞）

·藥理毒理·

Simultaneous determination of the contents of gallic acid and （+）-catechin in Diyu Shengbai tablet by HPLC

HUJia1， WANG Ze-yu1， GUANG Bing2， KANG Min1， LI Hong-xiang1， DENG Yun1//（1. School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan； 2. Chengdu Di'ao Pharmaceutical Group Co. Ltd. Chengdu 610041， Sichuan）

［Abstract］Objective: To establish a method for the simultaneous determination of gallic acid and （+）-catechin in Diyu Shengbai tablet by HPLC. Method: Determination was carried out on Inertsil ODS-3 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm， GL Sciences lnc.） with methanol- 0.05 phosphoric acid as mobile phase. The flow rate maintained at 1 mL.min-1. The column temperature was set at 30 ℃. Result: The calibration curve for gallic acid was linear in the range of 20.82～187.38 μg.mL-1， and for （+）-catechin was linear in the range of 20.90～188.10 μg.mL-1. The average recovery of gallic acid was 98.99% （RSD=1.88%），and （+）-catechin was 101.09% （RSD=0.58%）. Conclusion: This method is simple， sensitive and accurate which can be used for the quality control of Diyu Shengbai tablet.

［Key words］Diyu Shengbai tablet； gallic acid； （+）-catechin； HPLC； content determination

［中圖分類號］R 284.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-016-03

［基金項目］國 家科技部新藥創制重大專項（2014ZX0920102-008）；國家自然基金國家基礎科學人才培養項目（J13100340-12）；四川省科技廳中藥種質資源庫建設關鍵技術研究及示范 2014SZ0156

［作者簡介］胡 佳（1991-），女，在讀碩士，主要從事中藥活性成分方向研究

［通訊作者］李 鴻翔，男，實驗師，主要從事中藥化學成分物質基質研究

［收稿日期］2015-08-31