UPLC-MS/MS方法研究pongachin在肝微粒體中的代謝特征

李小彬，王海蓉，楊楸楠，肖昌彬，萬麗

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UPLC-MS/MS方法研究pongachin在肝微粒體中的代謝特征

李小彬，王海蓉，楊楸楠，肖昌彬，萬麗

［摘要］目的：采用不同種屬肝微粒體，研究黃酮類化合物pongachin的體外代謝特性，明確參與pongachin代謝的CYP酶亞型。方法：選擇UPLC-MS/MS測定方法，通過測定pongachin的剩余濃度，考察pongachin在人、大鼠和猴3個種屬肝微粒體中的代謝穩定性，以及在大鼠肝微粒體中的代謝表型。結果：pongachin在人、大鼠和猴肝微粒體中t1/2分別為36.86、30.13和20.50 min；其清除率為人＜大鼠＜猴。在大鼠肝微粒體中，CYP2E1、CYP2C、CYP1A2 對pongachin的代謝有較強抑制作用。結論：pongachin在人和大鼠肝微粒體中代謝穩定性較好（＞30 min），且在人和大鼠肝微粒體中代謝相似，在臨床上與其他抑制CYP2E1、CYP2C、CYP1A2代謝的藥物合用時應注意藥物間的相互作用。

［關鍵詞］pongachin；肝微粒體；代謝穩定性；代謝表型；UPLC-MS/MS

［作者單位］成 都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

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黃酮類化合物是自然界中分布最廣、數量最多的酚類化合物，具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗炎和免疫調節等活性［1～5］。Pongachin（圖1）是從水黃皮（Pongamia pinnata （L.）、灰毛豆（Tephrosia Purpurea）等藥用植物中提取分離出的二氫黃酮類成分，可通過誘導腫瘤壞死因子和細胞毒性作用而達到抗腫瘤效果［6-7］，并具有抗瘧原蟲［8］和廣譜殺蟲［9］等活性。

肝臟是藥物代謝的最重要器官，而藥物的代謝主要通過其中的細胞色素P450（CYP450）來完成［10］。所以目前在藥物研發過程中，研究主要CYP酶介導的代謝特性已經成為發現和篩選有效、安全的新化合物實體的必備環節［11］。由于目前國內外未有pongachin體外代謝的相關報道，因此本實驗采用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）方法測定pongachin在人、大鼠和猴肝微粒體中的濃度，考察pongachin在肝微粒體中的代謝穩定性，以及在大鼠肝微粒體中代謝的CYP表型，為深入了解pongachin的代謝特性和臨床安全、合理應用提供實驗依據。

圖1 pongachin的化學結構

1　儀器與試藥

三重四極桿質譜儀、超高效液相色譜儀（美國Waters）；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機，Thermo Scientific公司；DF-101S恒溫水浴鍋，鄭州匯成科工貿有限公司。pongachin（由四川大學生物治療國家重點實驗室分離得到，純度達99.7%）；內標（IS）刺芒柄花素（批號：01112916），INDOFINE chemical公司；人肝微粒體（HLM）、大鼠肝微粒體（RLM）、猴肝微粒體（MLM），蛋白濃度均為20 mg.mL-1，NADPH發生系統（A液、B液），均購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司，于-80°C冷凍保存；α-萘黃酮（CYP1A2抑制劑，東京化成工業株式會社）；鹽酸噻氯匹定（CYP2C19抑制劑，中國藥品生物制品檢定所）；奎尼丁（CYP2D6抑制劑，TCI上海化成工業發展有限公司；二乙基二硫代氨基甲酸鈉（CYP2E1抑制劑）（美國Sigma）；酮康唑（CYP3A4抑制劑，Dr Ehrenstorfer公司）；甲醇（色譜純）；純化水由實驗室自制；其余試劑為分析純。

2　方法與結果

2.1 LC-MS/MS方法

液相方法：色譜柱（Waters Acquity UPLCTMBEH C182.1×100 mm，1.7 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫（0～2 min 80%～90% A，2～4min 90%～80% A）。流速為0.2 mL.min-1，進樣時間為4 min；柱溫30 ℃；樣品室溫度為10 ℃；進樣體積5 μL。質譜方法：本實驗采用Quattro Premier XETM串聯四極桿質譜儀的電噴霧離子源（ESI+），多反應離子監測（MRM）模式，pongachin及IS刺芒柄花素的離子對和碰撞能量分別為m/z 337.15→m/z 203.20 （32 eV）和 m/z 269.20→m/z 197.20（28 eV）。毛細管電壓為2.8 kV，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔電壓 35 V，萃取錐孔氣40 L/Hr，脫溶劑氣600 L/Hr。

2.2 Pongachin測定方法的建立與驗證

2.2.1 專屬性 將無pongachin和內標的空白肝微粒體溶液、只加內標的肝微粒體溶液，按“2.3”項下后續處理方法處理，得到空白對照樣品和內標對照樣品，將pongachin按“2.3”項下的孵育系統進行孵育得實驗肝微粒體溫孵液樣品。將三組樣品進行LC-MS/MS分析，在相同保留時間處，孵育體系和內標中的雜質對pongachin的測定均無干擾（圖2），說明內源性雜質不干擾pongachin的測定，該方法專屬性良好。

圖2 空白對照樣品 （A）、內標對照樣品 （B）、pongachin肝微粒體溫孵樣品（C） 色譜圖

2.2.2 標準曲線 用0.1M的PBS溶液與肝微粒體、NADPH溶液配制理論濃度為5、10、50、100、500、1000、2000 ng.mL-1pongachin的系列對照樣品溶液，進行LC-MS/MS分析測定。以pongachin與內標的峰面積比（y）和pongachin濃度（x）繪制標準曲線并計算得回歸方程為y=0.0045x+0.0434，其相關系數大于0.99，在5 ～2000 ng.mL-1內線性關系良好。

2.2.3 準確度與精密度 按照標準曲線方法配制濃度15、500、1600 ng.mL-1低、中、高三個濃度質控樣品各5份，進樣分析，計算各濃度質控樣品的回收率表示準確度。連續3d測定該法制備的質控樣品，計算測定值的相對標準偏差（RSD%）為日內、日間精密度（表1）。由表1可知精密度與準確度的偏差均在15%內，表明該方法具有較好的準確度，儀器精密度良好。

表1 pongachin測定的準確度與精密度（n=5）

2.2.4 基質效應 將質控溶液與含相同濃度的pongachin對照品溶液分別進樣分析，測得的峰面積分別為A和B，基質效應表示為=A/B×100%，基質抑制率為=（1-A/B）×100%。測得其基質抑制率為3.02%～4.43%，小于5%，表明該提取方法基質效應可忽略不計。

2.3 肝微粒體代謝穩定性

用0.1 mol.L-1PBS溶液（pH 7.4）配制含蛋白0.5 mg.mL-1的各種屬肝微粒體孵育液，孵育體系總體積為200 μL。將pongachin（終濃度為1μmol.L-1）與上述孵育液混合，在37℃預孵育5 min后加入NADPH發生系統啟動反應。分別于反應0、5、10、15、20、30、60 min后，立即加入含IS 刺芒柄花素（100 ng.mL-1）的冰甲醇溶液400 μL終止反應，渦旋3 min，離心（4℃，13000 r.min-1）10 min，取上清液至LC-MS/MS檢測，定量分析pongachin的剩余量。以底物剩余百分數的自然對數與孵育時間經線性回歸可知，pongachin在HLM、RLM、MLM中0～20min呈良好的線性關系，其相應的線性回歸方程分別為y=-0.0188x+4.6232，R2=0.9803；y=-0.023x+4.6093，R2=0.9910；y=-0.0338x+4.6122，R2=0.9731，并求得斜率（k）。參考文獻［14-15］采用well-stirred模型求得pongachin的體外代謝穩定性參數，包括消除半衰期t1/2、肝微粒體中固有清除率CLint、體內固有清除率CL′int、肝清除率CLH和肝提取率ER。結果見圖3和表2。

圖3 pongachin（1μmol.L-1）在人、大鼠、猴肝微粒體中的代謝消除情況

表2 pongachin在各種屬肝微粒體中代謝穩定性測定結果

2.4 代謝表型確定

用K2HPO4緩沖液（pH 7.4）配制蛋白含量為0.5 mg.mL-1（線性代謝范圍內）大鼠肝微粒體孵育液，加入pongachin（1μmol.L-1，濃度小于其Km）和各選擇性抑制劑：α-萘黃酮（1 μmol.L-1）、鹽酸噻氯匹定 （25 μmol.L-1）、奎尼丁 （10 μmol.L-1）、二乙基二硫代氨基甲酸鈉 （50 μmol.L-1）、酮康唑 （1μmol.L-1）［12-13］，37℃預孵育5min后，加入NADPH發生液啟動反應，在反應0 min和5min時立即加含IS刺芒柄花素（100ng.mL-1）的冰甲醇溶液400 μL終止反應，渦旋3 min，離心（4 ℃，13000 r.min-1）15 min，取上清液5μL進樣。平行設置的空白對照組不加抑制劑同法孵育。樣品平行設置3份。由蛋白濃度和底物濃度（pongachin）分別與反應速率作圖（圖4A、4B）可知，在0.1～0.7 mg.mL-1蛋白濃度范圍內和0.1～1μmol .L-1底物濃度范圍內時，對底物pongachin的代謝呈線性消除關系。由于孵育時間需在代謝量的20%以內［16］及為了減少蛋白結合率，本實驗最終選擇pongachin濃度為1μmol.L-1，RLM蛋白濃度為0.5mg.mL-1，孵育時間為5min進行代謝酶抑制實驗。以Eadie-Hofstee法（V對V/［S］）作圖（圖5），可見一明顯的“S”圖形，表明pongachin可能由多種酶所催化代謝［17］。由各特異性抑制劑對pongachin在大鼠肝微粒體中代謝速率的影響圖（圖6）可知：與空白對照組相比，α-萘黃酮、鹽酸噻氯匹定、二乙基二硫代氨基甲酸鈉組代謝速率為59.74%、34.18%、15.37%，抑制效果明顯（P＜0.01），奎尼丁、酮康唑組對pongachin代謝沒有明顯抑制作用（P＞0.05）。表明pongachin可能主要由CYP2E1、CYP2C和CYP1A2催化代謝。

圖4 酶蛋白濃度及底物濃度對pongachin代謝的影響

圖5 不同底物濃度的Eadie-Hofstee圖

圖6 各選擇性化學抑制劑對RLM中pongachin代謝的影響

3　討論

本實驗成功建立了大鼠肝微粒體中pongachin 的UPLC-MS/MS檢測方法，其專屬性、線性、準確度和精密度以及基質效應驗證結果均符合生物樣品的測定要求。在肝微粒體代謝穩定性實驗中，pongachin在人和大鼠屬肝微粒體中半衰期均大于30min，說明其在人和大鼠肝微粒體中代謝穩定性較好［18］，其體外代謝參數結果亦表明pongachin在人和大鼠肝微粒體中代謝相似，提示該藥的臨床前實驗可能選擇大鼠作為候選實驗動物。另外，由于人肝微粒體價格昂貴，為節約成本，本實驗暫時采用大鼠肝微粒體進行代謝表型實驗。

代謝表型研究對分析藥物代謝所屬酶有重要作用，而化學抑制劑法是研究代謝酶表型的常用手段。肝微粒體表型實驗應首先確定藥物線性代謝的條件，所以通過穩定性實驗結果和蛋白濃度、底物濃度考察等預實驗，確定了最佳孵育時間、蛋白濃度和底物濃度。Eadie-Hofstee作圖法得到一明顯的“S”圖形，表明在大鼠肝微粒體中有多個CYP酶參與pongachin的代謝。選擇性化學抑制劑法結果表明，CYP2E1、CYP2C、CYP1A2可能是pongachin的主要代謝酶，提示在臨床上與其他抑制CYP2E1、CYP2C 和CYP1A2代謝的藥物合用時應注意藥物間的相互作用。鑒于CYP酶存在種屬差異性，本實驗室下一步將采用人肝微粒體實驗進行驗證。本實驗室現階段僅對pongachin進行了CYP酶層面的Ⅰ相代謝研究，接下來將進行葡萄糖醛酸反應的Ⅱ相代謝實驗，進一步闡明pongachin的體外代謝特征。

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（責任編輯：陳思敏）

·本草文獻·

Investigation of metabolism of pongachin in liver microsomes by UPLC-MS/MS

LI Xiao-bin， WANG Hai-rong， YANGQiu-nan， XIAO Chang-bin， WAN Li//（ School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: By investigating the metabolic characteristics of pongachin in human， rat and monkey liver microsomes to identify CYP isozymes responsible for pongachin metabolism. Method: The metabolic stability and the CYP 450 phenotype of pongachin in liver microsomes were determined by UPLC-MS/MS method. Result: The corresponding t1/2were 36.86， 30.13， 20.50 min for pongachin in human， rat and monkey liver microsomes， respectively， which indicated that the extent of metabolic rates in liver microsomes were in the order of human＜ in rat＜ in monkey. CYP2E1， CYP2C and CYP1A2 strong inhibited pongachin metabolism in rat microsomes. Conclusion: Pongachin showed good metabolic stability in human and rat liver microsomes （more than 30 min）. Meanwhile its metabolism in human was similar with that in rat. Potential drug-drug interaction should be vigilant when pongachin is co-administered with the medicines which can inhibit CYP2E1， CYP2C and CYP1A2.

［Key words］Pongachin； liver microsmes； metabolic stability； metabolic phenotype； UPLC-MS/MS

［中圖分類號］R285.5

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-019-04

［基金項目］十 二五重大新藥創制（2012ZX09103101-066）

［作者簡介］李 小彬，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥質量標準研究

［通訊作者］萬 麗，教授，博士生導師，主要從事為中藥質量標準研究

［收稿日期］2016-02-16