白緣5S rDNA的擴(kuò)增分析及其在染色體上的FISH定位

張偉偉，付元帥，邵燕，王寶琴，石東里，張?zhí)m

(1.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 ，上海 201306)

張偉偉1，付元帥2，邵燕1，王寶琴1，石東里1，張?zhí)m1

(1.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 ，上海 201306)

摘要：本文分別對雌雄白緣的5S rDNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列分析，并采用雙色熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，以白緣的5S rDNA序列和小麥的45S rDNA為探針，對其在白緣雌雄中期染色體上進(jìn)行了FISH定位研究。結(jié)果表明，白緣5S rDNA序列無雌雄差異；5S rDNA的保守區(qū)序列為117 bp；5S rDNA和45S rDNA分別被定位于白緣的性染色體和第5號(hào)染色體上。同時(shí)從GenBank中獲得了22種魚的5S rDNA，運(yùn)用DNAman軟件構(gòu)建了23種魚的系統(tǒng)發(fā)育樹，對白緣的進(jìn)化地位進(jìn)行了初步研究。本研究為闡明白緣在魚類系統(tǒng)進(jìn)化中的位置、重復(fù)序列在脊椎動(dòng)物性染色體上的分布狀況以及與性別決定與分化的關(guān)系，提供了資料積累和分析依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Liobagrus marginatus; PCR; 5S rDNA; 系統(tǒng)進(jìn)化樹; 染色體; FISH

1引言

核糖體RNA 基因(rDNA)是真核生物基因組中一類高度重復(fù)并有轉(zhuǎn)錄活性的基因家族。在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中已成為一種非常有用的遺傳標(biāo)記[5]。18S、5.8S、28S rDNA串聯(lián)在一起形成45S rDNA，排列在某一染色體上形成核糖體RNA基因簇[6]。5S rRNA基因是串聯(lián)重復(fù)的多拷貝基因，它們獨(dú)立存在，并不與主體 rRNA (18S-5.8S-28S rRNA ) 基因相連，在生物體內(nèi)含量豐富，廣泛分布，而且進(jìn)化上高度保守，因此常用來研究物種進(jìn)化和同源性分析，被稱為生物體內(nèi)的活化石[7]。在某些魚類中，45S rDNA 和 5S rDNA 位于相同的染色體上[8—9]，在大部分魚類中則位于不同的染色體上[10—11]。在某些有異型性染色體的物種中，5S rDNA 位于性染色體上[12—14]，有可能參與性別決定和分化。

2材料與方法

2.1材料

根據(jù) 5S rDNA 保守序列設(shè)計(jì)引物：

上游 P1：5′-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3′

下游 P2：5′-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3′

由上海生工生物工程公司合成。

2.2方法

2.2.25S rDNA 的擴(kuò)增、克隆及測序分析

2.2.3序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由 GenBank 獲得另外 22 種魚類的 5S rDNA的保守區(qū)序列(表1)，用 DNAman 軟件進(jìn)行序列比對分析，并構(gòu)建魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1　分析用標(biāo)本名錄、GenBank 序列號(hào)

2.2.4染色體標(biāo)本制備

2.2.5FISH 探針的制備

2.2.6熒光原位雜交

從-20℃取出染色體標(biāo)本，依次進(jìn)行如下處理：60℃烤片3 h；RNase A(0.1 μg/μL溶于 2×SSC中)，37℃處理1 h；2×SSC室溫洗滌3×2 min；70%，90%，100%乙醇梯度脫水，各2 min，室溫干燥；70%甲酰胺變性液(pH7.0)72℃變性3 min，立即轉(zhuǎn)入-20℃70%乙醇中，5 min后經(jīng)90%，100%(-20℃)系列乙醇脫水，各5 min，室溫干燥。將 5S rDNA和 45S rDNA 探針雜交液(標(biāo)記探針4 μL、20×SSC 4 μL、去離子甲酰胺 20 μL、20%硫酸葡聚糖4 μL、PBS(pH7.0)/適量水，總體積40 μL)，于100℃水浴變性10 min，冰浴5 min，加在處理過的染色體標(biāo)本上，加蓋玻片，橡皮泥封片，置80℃烤箱中3 min，轉(zhuǎn)入濕盒中37℃雜交20 h。

2.2.7熒光原位雜交的信號(hào)檢測

(1) 洗脫。雜交后的玻片，于2×SSC中除去蓋片，按下列程序洗脫：50%甲酰胺/2×SSC 45℃漂洗3×5 min；2×SSC45℃漂洗3×5 min；BUFI室溫漂洗5 min。

(2) 封阻。BUFⅡ37℃封阻30 min。

(3) 檢測。按下列程序檢測雜交信號(hào)，所有操作均在暗處進(jìn)行：鏈親和素-Cy3(Streptavidin-Cy3)和抗地高辛(Anti-Dig-Fluorescein Fab fragments)混合液，37℃結(jié)合30 min；BUFI漂洗3×5 min；生物素化鏈抗親和素(Biotinylated anti-streptavidin)和羊抗地高辛偶聯(lián)物(Fluorescein Anti-sheep IgG)混合液，37℃結(jié)合30 min；BUFI漂洗3×5 min；鏈親和素-Cy3 37℃結(jié)合30 min；BUF I漂洗3×5 min。70%、90%、100%系列乙醇脫水，各5 min，20 μg/mL DAPI復(fù)染，并加入抗熒光萃滅劑PPD(0.5 μg/mL)，蓋上蓋玻片，橡皮泥封片后，用Olympus BX60型熒光顯微鏡觀察雜交結(jié)果并照片記錄，然后對照片結(jié)果進(jìn)行分析。

3結(jié)果與分析

3.1基因組 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及序列測定

提取的基因組DNA經(jīng)電泳和分光光度計(jì)檢測，具有較高的純度和濃度，將雌雄基因組DNA分別稀釋成同一濃度(約 15 ng/uL)。采用 PCR 擴(kuò)增 5S rDNA 基因序列，得到 250、450 和 1 200 bp 左右的3條擴(kuò)增帶，經(jīng)克隆測序和GenBank中Blast分析，確定白緣魚央的5S rDNA保守區(qū)序列為 117 bp(圖1)，并且發(fā)現(xiàn)在 5S rDNA 保守區(qū)之間存在不同的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Nontranscribed Spacers，NTS)序列。

3.2序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

3.3染色體標(biāo)本制備

3.45S rDNA 和 45S rDNA 在染色體上的 FISH 定位

圖1　23 種魚的 5S rDNA 基因的序列比對分析Fig.1　The sequence alignment analysis of 5S rDNA gene of 23 fishes

圖2　基于 5S rDNA 序列構(gòu)建的 23 種魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2　Phylogenetic tree of 23 fishes based on 5S rDNA sequences

圖3　5S rDNA和45S rDNA對白緣雄性中期染色體的FISH分析Fig.3　Localization of 5S rDNA Probe and 45S rDNA by FISH in male samples of Leiobagrus marginatusa.5S rDNA和45S rDNA 在中期染色體上的分布； b.白緣基于5S rDNA和 45S rDNA FISH圖像核型圖a.Distribution of 5S rDNA and 45S rDNA on metaphase;b.Homologous pairing of chromosomes based on 5S rDNA and 45S rDNA FISH

圖4　5S rDNA和45S rDNA FISH定位后白緣染色體的Giemsa染色分析Fig.4　Giemsa Karyotype of the male Leiobagrus marginatus after FISH localization of 5S rDNA and 45S rDNA

4討論

45S rRNA 基因簇在不同的生物中存在于不同的染色體上，該基因簇由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，在不同的真核生物中含有幾百到幾千個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列由保守的密碼序列區(qū)和變異較快的非密碼間隔區(qū)組成，密碼序列區(qū)(18S、5.8S、28S rRNA結(jié)構(gòu)基因)與非密碼間隔區(qū)(即轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))相間排列，在細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)整個(gè)重復(fù)序列均可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。真核生物 45S rRNA 基因簇中的串聯(lián)重復(fù)序列在進(jìn)化上表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)囊恢滦裕⑶以诜N內(nèi)的獨(dú)特性序列的同質(zhì)性相對較高，但其他非獨(dú)特性序列仍有一定的差異性。因此日益成為近親分類群間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳多樣性等研究中的優(yōu)良分子遺傳標(biāo)記。本研究通過 FISH 技術(shù)將 45S rDNA 定位于白緣魚央有絲分裂中期 5 號(hào)染色體的中部著絲粒處，但是否與 45S rDNA 位于染色體上核仁組織區(qū)(NORs)相一致，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

5S rDNA在染色體上的位置不像 45S rDNA 那樣有與核仁相連系的明顯的特征，關(guān)于它的定位，在不同物種間差異較大。在一些魚類中，發(fā)現(xiàn) 5S rDNA 分布于性染色體上[12，19—20]。本研究發(fā)現(xiàn)，白緣魚央的 5S rDNA 也位于其性染色體上，并且靠近 X 和 Y 染色體的著絲粒處。綜合以前研究，5S rDNA 位于性染色體的這種現(xiàn)象是否就說明其與該物種性染色體相連鎖或與性染色體進(jìn)化有關(guān)，或者說與性別決定或性別分化有關(guān)，都有待于今后進(jìn)一步的深入研究和探討。

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The amplification and FISH analysis of 5S rDNA in Liobagrus marginatus

Zhang Weiwei1，F(xiàn)u Yuanshuai2，Shao Yan1，Wang Baoqin1，Shi Dongli1，Zhang Lan1

(1.ShandongProvincialEngineeringandTechnologyResearchCenterforWildPlantResourcesDevelopmentandApplicationofYellowRiverDelta，BinzhouUniversity，Binzhou256603，China；2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract:In present research，5S rDNA was amplified by the usual 5S rDNA primers in Genomic DNA of female and male Liobagrus marginatus，and sequenced. The results of amplification showed that there were not different in 5S rDNA between female and male of L.marginatus，and length of 5S rDNA was 117 bp. Using the method of double color Fluorescence In situ Hybridization (FISH)，5S rDNA and 45S rDNA on metaphase chromosomes were located in L.marginatus. The results showed that 5S rDNA and 45S rDNA were located on sex chromosome and the 5th chromosome，respectively. Phylogenetic tree of 5S rDNA in L.marginatus and 22 fishes else was constructed by DNAman，so evolution position of L.marginatus in fishes was studied preliminarily. This study offer data accumulating and basis of analysis，to illustrate phyletic evolution of fishes and repeat sequences on sex chromosome，and relation of heterochromatin or repeat sequences and sex determination & differentiation in vertebrates．

Key words:Liobagrus marginatus; PCR; 5S rDNA; phylogenetic tree; chromosome; FISH

收稿日期：2015-06-03；

修訂日期：2015-12-24。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400401)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013EML002)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011YD21020)。

作者簡介：張偉偉(1981—)，女，山東省淄博市人，講師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物分子細(xì)胞遺傳。E-mail:wwzhang1225@163.com

中圖分類號(hào):S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253-4193(2016)06-0082-07

Zhang Weiwei，Shao Yan，Wang Baoqin，et al. The amplification and FISH analysis of 5S rDNA inLiobagrusmaginatus[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：82—88，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.009