益腎化濁方對快速老化小鼠認知功能與海馬神經元形態學的影響及機制

宋宛珊　張玉蓮　周　震　張琳琳　韓文文　王　凱

(天津中醫藥大學，天津　300193)

益腎化濁方對快速老化小鼠認知功能與海馬神經元形態學的影響及機制

宋宛珊1張玉蓮1周震1張琳琳1韓文文1王凱

(天津中醫藥大學，天津300193)

〔摘要〕目的探討益腎化濁方對阿爾茲海默病模型快速老化鼠(SAMP)8空間記憶能力、海馬神經元形態學的影響及其作用機制。方法將48只9月齡健康雄性SMAP8采用雙盲法隨機分為SAMP8組、安理申組、益腎化濁方組，每組16只，另取16只SAMR1作為對照組。各組小鼠分別灌胃給予安理申(30 mg/kg)、益腎化濁方(20 g/kg)或等體積0.9%生理鹽水，2次/d，連續14 w。分別采用Morris水迷宮檢測空間學習記憶能力，尼氏染色觀察細胞凋亡情況，電鏡觀察神經元超微結構，RT-PCR、Western印跡檢測β-淀粉樣蛋白前體(APP)、早老蛋白(PS1)基因和GSK-3β蛋白表達。結果與對照組比較，SAMP8組游泳總路程、逃避潛伏時間、海馬CA1區神經元凋亡數目和APP、PS1基因及GSK-3β蛋白表達量均顯著增加(P<0.01)，穿越平臺次數顯著減少(P<0.01)，游泳速度顯著降低(P<0.01)，超微結構損傷明顯；與SAMP8組比較，安理申組與益腎化濁方組游泳總路程明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺次數明顯增加(P<0.01)，游泳速度亦顯著加快(P<0.01)，同時顯著減輕神經元超微結構損傷；此外，安理申可顯著下調GSK-3β蛋白表達(P<0.01)，益腎化濁方可顯著減少神經元凋亡數目(P<0.01)，同時下調APP、PS1基因表達(P<0.01)；組別和訓練天數對逃避潛伏時間、總路程、穿越平臺次數有明顯影響(P<0.01)。結論益腎化濁方可有效提高SAMP8的空間記憶能力，抗神經元凋亡并保護神經元超微結構，其作用機制可能與下調APP、PS1基因和GSK-3β蛋白的表達相關。

〔關鍵詞〕阿爾茲海默病；益腎化濁方；認知功能；神經元凋亡；超微結構

阿爾茨海默病(AD)的主要病理機制可能是過度磷酸化的Tau蛋白和淀粉樣蛋白斑(Aβ)相互作用形成神經元纖維纏結，進而引起神經元及突觸損傷〔1,2〕。近年來，單一靶點治療AD的藥物研發逐漸停滯，多靶點治療AD的藥物得到了更多關注。本課題組臨床研究證實了益腎化濁方可顯著改善輕度AD(腎虛證)患者的中醫癥狀，能一定程度地改善其認知功能及日常生活能力〔3〕；藥理研究表明，益腎化濁方可通過整體多靶點調節神經-內分泌-免疫網絡(NEI網絡)相關指標，促進 AD 模型大鼠海馬區腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體 TrkB 蛋白的表達，進而改善其學習記憶功能〔4,5〕。本研究在此基礎上，觀察益腎化濁方對快速小鼠(SAMP)8海馬的影響，探討益腎化濁方防治AD的可能作用機制。

1材料與方法

1.1動物48只健康雄性SAMP8和16只健康雄性SAMR1鼠齡9個月±3 d，體重(30±2)g。小鼠飼養環境：溫度(23±1)℃，濕度50%～60%，自由飲食、飲水，12 h/12 h明-暗循環光照。所有動物由天津中醫藥大學第一附屬醫院動物中心提供〔許可證號:SCXK(津)2010-0001〕，飼養程序均依照中國實驗動物管理規章要求操作，并且經天津中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器淀粉樣蛋白前體(APP)單克隆抗體、早老蛋白(PS)1抗體、GSK-3β抗體均購于Cell Signaling Technology(CST)公司；羊抗兔抗體購自millipore公司；SDS-PAGE膠配制套裝購于碧云天；Trizol購于Invitrogen；安理申(5 mg/片×7片/板×1板/盒，批號：110507A)購于衛材(中國)藥業有限公司；全自動多功能顯微鏡(Leica dm rxa2)為德國萊卡公司產品；透射電子顯微鏡(H-7500型)為日立建機株式會社產品。

1.3益腎化濁方的制備益腎化濁方的組成：淫羊藿10 g、補骨脂10 g、女貞子10 g、制首烏12 g、炙黃芪10 g、川芎10 g、石菖蒲12 g。將上述藥物370 g(5付)加1 000 ml水浸泡12 h,80℃超聲30 min，過濾，保存濾液；濾渣再加1 000 ml水采用同樣條件重復超聲2次，殘渣棄去。將3次所得濾液合并，過濾,100℃水浴加熱，濃縮至370 ml，生藥濃度為1 g/ml。由天津中醫藥大學制劑中心制備，4℃保存備用。

1.4方法

1.4.1動物造模和分組48只SAMP8隨機分為SAMP組、安理申組、益腎化濁方組，每組16只。16只SAMR1作為空白對照組。安理申組和益腎化濁方組分別給予安理申、益腎化濁方灌胃治療，給藥劑量為安理申30 mg/kg，益腎化濁方20 g/kg，2次/d，連續灌胃14 w。SAMR1組和模型組灌胃給予等量0.9%生理鹽水。每組隨機選取10只小鼠用于水迷宮、RT-PCR和Western印跡實驗，3只小鼠用于Nissl染色，3只小鼠用于透射電鏡觀察。

1.4.2Morris水迷宮參照文獻〔6〕方法，實驗前1 d，水池中不放置平臺，讓小鼠自由游泳60 s，使其熟悉水迷宮環境。實驗中，訓練小鼠定位始終位于東北象限中間的隱藏平臺。實驗時，從第一象限池壁選擇并標記兩個與逃逸平臺等距的入水點，將小鼠從其中一個入水點面向池壁放入水中。當小鼠爬到隱蔽平臺上即停止實驗；小鼠爬到隱蔽平臺上后讓其停留30 s，下一個實驗中將小鼠從另一個入水點放入水中以找到隱蔽平臺即停止實驗并計時。至60 s找不到平臺，則潛伏期記為60 s，如果小鼠在平臺上停留至少3 s，則說明找到平臺。如果小鼠沒有停留地通過平臺或找到平臺后立刻跳入水中，則繼續實驗，直到小鼠成功找到平臺。正式實驗連續進行5 d。

1.4.3Nissl染色行為學實驗結束之后，每組隨機選取3只小鼠，6.5%水合氯醛麻醉，再用60 ml冷藏的4%多聚甲醛(以0.1 mol/L PBS溶解)和30 ml 0.9%生理鹽水灌注。取小鼠大腦，固定、脫水、石蠟包被，用旋轉式切片機切成25 μm薄片。石蠟切片在1%甲苯胺藍中56℃染色20 min，用70%乙醇處理1 min，再經95%乙醇處理，脫水，洗凈，中性樹膠封片。計數單位面積神經元數量，計算均值。

1.4.4透射電鏡超微結構觀察小鼠直接脫頸處死，快速斷頭取腦，在冰上取海馬齒狀回(DG區)1 mm3的組織塊放入前固定液(4%戊二醛固定液)中，以上步驟在3 min之內完成。7 d之內進行鋨酸固定、乙醇系列脫水、樹脂包埋聚合，制成50 nm的超薄切片。醋酸鈾30～40 min和檸檬酸鉛30 min雙重電子染色，置于透射電鏡下觀察海馬CA1區超微結構。

1.4.5實時定量RT-PCR(1)設計和合成引物:檢測mRNA的引物由Primer5.0設計，由大連TAKARA生物公司合成，引物序列見表1。(2)總RNA提取和RT-PCR:總RNA由隨機引物和RT試劑盒進行反轉錄，根據說明書步驟操作。應用Bio-Rad公司熱循環擴增儀進行擴增，獲得每個樣品每次反應的Ct值，計算得到△Ct，樣品間基因表達的相對定量用2-△△CT表示。所有樣品均由三個獨立實驗平行三次取平均值。

表1　RT-PCR引物序列

1.4.6Western印跡實驗取每只SAMP8的海馬區，提取總蛋白，檢測蛋白濃度，用SD上樣緩沖液處理樣品，10%SDS-PAGE電泳分離，轉至硝酸纖維素膜上。一抗均用PBS按1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。用含0.1%吐溫20的PBS(PBST)清洗3次，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體作為二抗(稀釋比例1∶5 000)，室溫孵育1～1.5 h，0.1% PBST清洗3次，采用ECL化學發光法檢測。用圖像分析軟件分析條帶灰度值，進行半定量分析。

1.5統計學分析Morris水迷宮所得數據除平均游泳速度外，均采用two-way ANOVA和Bonferroni′s past hoc檢驗，平均游泳速度和其余結果均行t檢驗。所有數據均用PRISM6.0軟件處理，Bonferroni's past hoc檢驗以P<0.008 5為差異有統計學意義，其余檢驗均認為P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1益腎化濁方對小鼠學習和記憶能力的影響水迷宮行為學測試主要分為定位航行實驗(逃避潛伏時間和總路程)和空間探索實驗(穿越平臺次數和平均速度)兩部分。水迷宮軌跡圖顯示，與SAMP8組相比，益腎化濁方組尋找平臺更具有趨向性，但其尋找方式仍次于SAMR1組(圖1A)。組別和訓練天數均可顯著影響逃避潛伏時間、總路程、穿越平臺次數、平均速度(P<0.01)，兩者之間交互作用僅對穿越平臺次數有明顯影響。

與對照組比較，SAMP8組逃避潛伏時間、總路程明顯增加(P<0.01)，穿越平臺次數明顯減少(P<0.01)，平均速度明顯減慢(P= 0.010 7)；與SAMP8組比較，安理申組與益腎化濁方組逃避潛伏時間、總路程明顯減少(P<0.01)，穿越平臺次數增加(P=0.086 6)，平均速度顯著增加(P<0.01)；與安理申組比較，益腎化濁方組逃避潛伏時間顯著縮短(P<0.01)，但總路程和平均速度改善程度均低于安理申組(P<0.01)，穿越平臺次數則無明顯差異(P=0.30)(圖1B、1C、1D、1E)。

A:水迷宮路徑圖，B:逃避潛伏時間，C:總路程，D:穿越平臺次數，E:游泳速度圖1　各組小鼠空間記憶能力變化情況

2.2益腎化濁方對小鼠海馬CA1區神經元凋亡的影響與對照組〔(2.00±1.00)個〕比較，SAMP8組海馬CA1區神經元凋亡數目〔(25.00±5.00)個〕明顯增加(P=0.001 4)；與SAMP8組比較，安理申組海馬CA1區神經元凋亡數目〔(19.00±3.00)個〕無明顯變化，而益腎化濁方組海馬CA1區神經元凋亡數目〔(15.00±3.00)個〕明顯減少(P=0.041 1)；益腎化濁方組與安理申組無顯著差異(P=0.177 8)(圖2)。

圖2　小鼠海馬CA1區神經元凋亡情況

2.3益腎化濁方對小鼠海馬CA1區超微結構的影響對照組神經元線粒體結構基本完整，可見比較清晰的嵴和膜，粗面內質網顆粒均勻，游離核糖體均勻分布于細胞質之中，可見脂褐素；SAMP8組神經元細胞質輕重度水腫，線粒體絕大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，可見嵴斷裂及缺失現象，粗面內質網可見重度顆粒融合及脫顆粒現象，游離核糖體重度減少；安理申組神經元線粒體大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，可見嵴斷裂及缺失現象，線粒體可見空化現象，粗面內質網可見中度顆粒融合及脫顆粒現象；益腎化濁方組神經元線粒體部分嵴和膜融合、模糊不清，粗面內質網有中度顆粒融合及脫顆粒現象，可見脂褐素和次級溶酶體(圖3)。

圖3　小鼠海馬CA1區神經元超微結構(×4 000)

2.4益腎化濁方對小鼠APP和PS1基因表達的影響與對照組(1.00±0.00)比較，SAMP8組海馬區APP mRNA表達(2.38±0.61)明顯增加(P=0.001 8)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區APP mRNA表達(1.83±0.85)無明顯差異，而益腎化濁方組海馬區APP mRNA表達(1.27±0.16)明顯減少(P=0.004 5)，益腎化濁方組與安理申組無明顯差異(P=0.100 7)。與對照組(1.00±0.55)比較，SAMP8組海馬區PS1 mRNA表達(1.73±0.62)明顯增加(P=0.012 2)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區PS1 mRNA表達(1.37±0.27)無明顯變化，而益腎化濁方組海馬區PS1 mRNA表達(1.01±0.16)明顯減少(P=0.002 4)；益腎化濁方組與安理申組無明顯差異(P=0.350 9)。

2.5益腎化濁方對小鼠GSK-3β蛋白表達的影響與對照組(0.69±0.08)比較，SAMP8組海馬區GSK-3β蛋白表達(1.00±0.28)明顯增加(P=0.003 4)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區GSK-3β蛋白表達(0.66±0.14)明顯減少(P=0.003 0)，而益腎化濁方組海馬區GSK-3β蛋白表達(0.94±0.16)無明顯變化；與安理申組比較，益腎化濁方組海馬區GSK-3β蛋白表達明顯增加(P=0.000 6)(圖4)。

圖4　GSK-3β蛋白表達情況

3討論

AD屬祖國醫學“癡呆”范疇，其發病與中醫五臟中腎的關系最為密切，腎虛精虧、髓海不足是AD形成的基本病機并始終貫穿其全過程〔7，8〕。隨著腎精虧虛，其他臟腑功能也相應虛衰，氣血運化不暢成瘀，津液失于布化為痰，痰瘀互結，釀生濁毒而痹阻腦絡，因腎虛所致的濁毒成為AD發病的主要因素。在中醫經典臟象理論“腎藏精”、“腎生髓通于腦”理論的指導下，投用補腎益精、化濁開竅方藥切中病機。方由制首烏、女貞子、淫羊藿、補骨脂、石菖蒲、炙黃芪、川芎七味中藥組方，方中制首烏、女貞子補肝腎，益精髓；淫羊藿、補骨脂壯腎陽，溫腎精，以應“陰中求陽，陽中求陰”之意；菖蒲化痰開竅，黃芪補氣行血，川芎辛散上行，為血中氣藥，三者合用可達化濁開竅之目的，諸藥相輔相成，共奏補腎益精、化濁開竅之功。

SAMP8是生命過程正常的小鼠，可作為抗快速老化系(SAMR)的品系之一，其壽命一般為12～13個月。研究發現〔9,10〕,SAMP8生長6個月后，海馬區即有Aβ1～40、Aβ1～42沉積產生，其數量隨著年齡增加而不斷增多，同時伴有Tau蛋白磷酸化，導致神經遞質、蛋白基因表達等改變，因此，SAMP8可作為AD動物模型。

Morris水迷宮是用來測量嚙齒動物空間學習和記憶的量化指標與主要工具〔11～13〕，Nissl染色則是觀察神經元丟失的主要檢測手段之一。本研究發現，益腎化濁方可有效改善SMP8的空間認知功能，并減少海馬CA1區神經元的缺失，改善神經元細胞器等結構，其細胞質內出現了正常老化神經元常見的脂褐素、次級溶酶體結構，提示益腎化濁方可改善神經元自身代謝，使神經元更趨向于正常老化。

Aβ是APP的代謝產物〔14〕。APP是一種跨膜蛋白質，廣泛存在于人體各種組織中，以腦組織中表達最高。其有兩種水解途徑：一是被α分泌酶水解，生成可溶性的α-APPs和C83片段多肽，不產生Aβ片段；二是在胞質溶酶體內由β分泌酶首先裂解產生可溶性的APPs，剩余部分再通過γ分泌酶裂解，產生Aβ碎片。在某些病理條件下，APP第二條水解途徑開啟，促使大量Aβ堆積，其中大約90%為Aβ1～40片段，剩余大部分是Aβ1～42片段，均具有很強的細胞毒性，是加速誘發AD的重要原因〔15,16〕。Aβ1～42/Aβ1～40還受PS1基因的影響，PS1參與γ分泌酶裂解APP的過程，它可以導致Aβ1～42/Aβ1～40比例增加，細胞毒性增強，進而引起神經元的丟失〔17,18〕。本研究發現，益腎化濁方可顯著抑制APP、PS1基因的表達，可能會進一步減少Aβ，尤其是Aβ1～42片段的生成，從而延緩AD發展。

近些年，Tau蛋白假說備受關注。Tau蛋白在神經細胞中的主要作用是穩定微管，其C末端易導致纖維結構聚集。GSK-3β可以促使Tau蛋白C末端高度磷酸化，使Tau蛋白具有很強的神經毒性，導致神經元缺失〔19～22〕。此外，GSK-3β還參與APP的β分泌酶與γ分泌酶水解，促使神經元軸突崩解，認知功能下降〔23〕。本研究發現，益腎化濁方和安理申均可一定程度地降低GSK-3β蛋白的表達，但安理申效果更明顯。

綜上所述，益腎化濁方可通過下調APP、PS1基因與GSK-3β蛋白的表達，抑制海馬CA1區神經元凋亡，改善神經元超微結構，增強SAMP8空間學習和記憶能力。與安理申相比，該方作用靶點更多，充分體現了中藥復方多成分、多靶點的作用特點，作用時間較持久，為防治AD提供了新的選擇。

4參考文獻

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〔2015-09-14修回〕

(編輯郭菁)

Effects and mechanisms of Yishenhuazhuo recipe on the cognitive function and hippocampus neurons morphology of SAMP8 mice

SONG Wan-Shan,ZHANG Yu-Lian,ZHOU Zhen,et al.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

【Abstract】ObjectiveTo study effects and mechanisms of Yishenhuazhuo recipe(YSHZR)on spatial learning and memory and the hippocampus neurons morphology in the senescence-accelerated prone 8(SAMP8)mice.MethodsForty-eight of 9-month-old SAMP8 mice were randomly allocated to model(SAMP8 mice),Aricept treated and YSHZR treated groups.Meanwhile,sixteen senescence-resistant 1(SAMR1)mice were used as controls(SAMR1 group).Aricept(30 mg/kg),YSHZR(20 g/kg)or equal-volume saline(SAMR1 and SAMP8 mice)was administered in each mouse for 14 weeks by gastric infusion twice per day.Spatial learning and memory were measured by the Morris water maze.Neuronal apoptosis was quantified by Nissl staining.The mRNA expression of APP and PS1 and the protein expression of GSK-3β in the hippocampus were detected by RT-PCR and Western blot respectively.ResultsCompared with SAMR1 group,the path length,escape latency,number of neuronal apoptosis,GSK-3β protein and APP,PS1 gene expression in hippocampal CA1 of SAMP8 mice were significantly increased(P<0.01),frequency of entrance was significantly reduced(P<0.01),the swim speed was also significantly lowered(P<0.01),and the neuronal ultrastructural damage was very evident;compared with SAMP8 group,the path length in Aricept group and YSHZR group of mice were significantly shorter(P<0.01),the frequency of entrance was significantly increased(P<0.01),swim speed was also significantly faster(P<0.01),and neuronal ultrastructure damage was significantly reduced;moreover,Aricept significantly reduced GSK-3β protein expression(P<0.01),but YSHZR could significantly reduce the number of neuronal apoptosis(P<0.01),and down-regulate the gene expression of APP,PS1(P<0.01);groups and training days had significant effects on escape latency,total distance and the number of cross platform(P<0.01).ConclusionsYSHZR plays a role of improving spatial memory,reducing neuronal apoptosis and protecting ultrastructure,which may be related to down-regulating the expression of APP,PS1 gene and GSK-3β protein.

【Key words】Alzheimer′s disease;Yishenhuazhuo recipe(YSHZR);Cognitive function;Neuronal apoptosis;Ultrastructure

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2010CB530405)

通訊作者：張玉蓮(1963-)，女，博士，主任醫師，博士生導師，主要從事中醫腦病臨床與基礎研究。

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2586-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.009

1天津中醫藥大學第二附屬醫院

第一作者：宋宛珊(1987-)，女，博士，主治醫師，主要從事中醫腦病臨床與基礎研究。