野生圓口銅魚卵巢成熟內分泌信號表達分析

夏雨果陳曉文賀江燕劉家壽殷 戰（.中國科學院水生生物研究所水生生物多樣性與保護重點實驗室，武漢 430072； 2.中國科學院大學，北京 00049）

野生圓口銅魚卵巢成熟內分泌信號表達分析

夏雨果1，2陳曉文1賀江燕1劉家壽1殷 戰1
（1.中國科學院水生生物研究所水生生物多樣性與保護重點實驗室，武漢 430072； 2.中國科學院大學，北京 100049）

摘要：圓口銅魚（Coreius guichenoti）是一種呈群同步發育繁殖的魚類，對其卵巢成熟各時期特征分析，可進一步了解魚類卵巢成熟的分子調控機制，并為人工催產實踐提供理論支持。研究以野生雌性圓口銅魚不同發育時期的卵巢為研究對象，通過現場卵巢解剖觀察以及實驗室內組織學分析，收集處于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的卵巢組織樣本進行轉錄組分析。研究顯示野生圓口銅魚卵巢組織在其成熟發育各階段具有明確的組織學和轉錄表達特征。研究采用全序列轉錄組測序分析，以鯉科模式魚類斑馬魚的基因序列作為主要參考序列，共檢測得到11495 bp基因片段。聚焦內分泌/自分泌信號分子的轉錄表達，發現促乳素（Prolactin，prl）、卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，fsh）、雌激素（Estrogen）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成酶類、生長/分化因子9（Growth/differentiation factor 9，gdf9）、激活素（Activin）、和抗穆氏管激素（Anti-Müllerian hormone，amh）等轉錄表達和卵巢發育成熟呈現出顯著的關聯動態變化。通過對樣品中卵巢成熟誘導激素（Maturationinducing hormone，MIH）合成酶分子的表達水平的觀察，發現涉及MIH的17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one的合成酶分子表達水平較高，而另一種MIH分子11-deoxycorticosteron的合成酶的表達水平處于檢測水平之下，因此，提示17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one可能是圓口銅魚卵巢成熟后期的主要促進因子。同時，發現了完整的膽酸合成酶系列分子在卵巢轉錄組中的存在，這是魚類卵巢組織中具有合成膽酸能力的首次報道，其生理作用有待進一步研究?？傊?，作為一種群同步發育的魚類，此項研究為魚類卵巢成熟發育過程中的內分泌信號調控網絡提供了大量的數據參考。

關鍵詞：圓口銅魚； 卵巢成熟； 轉錄組測序分析； 內分泌/自分泌信號

大部分的硬骨魚類都屬于卵生動物，在雌性生殖系統中產生卵黃，并伴隨著卵成熟的發育過程。硬骨魚類雌性卵巢的發育過程存在多樣性，包括同步發育（單批產卵）、群同步發育（分批產卵）和異同步發育（連續產卵）類型。對于同步發育類型的魚類，卵細胞同步發育并一次性產完所有的卵，所有的卵粒在短期內排出。而對于群同步發育的類型，在繁殖的卵巢內，至少存在著兩個發育階段的卵粒。在繁殖季節，這些卵粒發育至成熟，之后分幾個批次成熟排出。對于異同步發育類型的魚類，卵巢中包含著各種不同發育階段的卵泡，并能在全年任何階段產卵。盡管繁殖策略存在多樣化，但是在卵母細胞的發育成熟過程中，總是伴隨著一些共同的形態學和生理學特征的變化［1］。生殖腺的發育過程也是一個動態的過程，這個過程包含著許多與組裝和修飾細胞組成的相關因子之間的協作調控，用以支持配子的發育。這個過程是通過大量的結構和功能的轉變來完成的，包括初級卵母細胞形成、卵黃形成、卵母細胞成熟及生發泡破裂（Germinal vesicle breakdown，GVBD）。許多早期的研究關注了內分泌、旁分泌因子對魚類卵巢發育的調控及影響，近年來，轉錄組學分析技術的應用為研究不同繁殖策略的硬骨魚類卵巢發育及排卵的分子調控機制提供了寶貴的方法［1，2］。迄今為止，有關卵巢發育的轉錄表達的工作較多地在模式魚類，如斑馬魚（Danio rerio）、鰷（Pimephales promelas）［3，4］，由于這些模式魚類均為非同步發育卵的代表，因此難以開展對不同成熟時期的卵巢特征的研究。盡管近期在養殖魚類，如花條鱸（Morone saxatilis）、橄欖比目魚（Paralichthys olivaceus）等也有關于卵巢轉錄組研究報道，但這些研究或者采用的定量效率較弱基因芯片技術、抑或是各期卵巢的混合樣品，其關注的依然是卵巢器官特異基因表達的特性分析，而非對不同成熟期的卵巢轉錄特征進行分析［5，6］。

圓口銅魚（Coreius guichenoti），廣泛分布于長江的上游地區，是一種重要的經濟淡水魚類。圓口銅魚的幼魚會在長江的重慶至宜賓江段生活3—4年，之后逐步上溯600—1000 km至水流湍急及水溫更低的上游江段。成魚（體重約500—2000 g）群體生活于長江的上游江段，并在每年的4—7月進行產卵活動。近年來，長江上游包括三峽大壩、溪洛渡大壩和向家壩的建設，導致這種洄游性魚類種群資源受到了威脅。近來，關于圓口銅魚的人工養殖已經開展了一些工作，目的在于一方面保護野生魚類群體，另一方面以期未來能繼續利用具有重要經濟價值的魚類。然而，由于圓口銅魚的養殖過程中病害造成的大量損失，以及圓口銅魚相對長的成熟周期，使在網箱中飼養的圓口銅魚很難發育至性成熟期。因此，圓口銅魚苗種的獲得面臨困難，隨著在原有圓口銅魚成熟江段可以獲取的野生成熟雌性群體不斷下降，研究圓口銅魚的催熟技術以推動人工繁殖的發展已經迫在眉睫。

本研究采用以轉錄組分析為基礎的方法來探討圓口銅魚卵巢成熟過程中的分子特征。RNA-seq（轉錄組測序分析）是轉錄組研究的新方法，它為基因組序列信息不完善的非模式生物的轉錄組學分析研究提供了可能［7］。本研究采用這種方法研究圓口銅魚卵巢發育過程中各個發育階段的基因表達特征，將增加對硬骨魚類卵母細胞發育過程的基因表達與調控網絡的理解，該項研究結果也將為針對各卵巢發育階段提供潛在的、能應用于水產養殖的分子標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

成熟的雌性圓口銅魚樣品的采集時間為2012和2013年的4—5月，采集地點云南省華坪縣，位于金沙江中、下游，采樣工具為滾鉤、餌鉤。采集的魚類樣品，用麻醉使其昏迷，測量全長（mm）、體重（g）、性腺重（g）。性體指數GSI（Gonadosomatic index），計算公式如下:GSI=性腺重/體重×100%。取部分卵巢樣品保存于波恩溶液中，用于之后的組織學分析。部分樣品保存于RNAlater溶液中（AM7020，Life Technologies），用酒精擦拭過的剪刀將RNAlater溶液中樣品剪碎，并迅速冷凍保存用于提取RNA。所有野生樣品的采集得到云南省農業部門許可。

將波恩溶液中固定的卵巢組織樣本包埋在石蠟中并切成6—12 μm的連續切片。卵巢的染色利用標準的蘇木精和伊紅溶液。圓口銅魚的卵巢分期參見Selman［8］，將卵巢分為5個時期。在卵巢分期的任何一個階段，卵巢表現出異質性，包含了不同發育階段的卵粒。卵巢分期基于最成熟的卵母細胞階段，在10倍和40倍顯微鏡下進行分辨。選取代表性的發育期Ⅲ期（卵黃形成期）、Ⅳ期（卵母細胞成熟期）和Ⅴ期（排卵期或成熟卵期）雌魚各1尾，取卵巢樣品進行轉錄組測序分析。

1.2 RNA提取及純化

RNA提取采用RNeasy Mini Kit（Qiagen）試劑盒，提取RNA后用RNase-free DNaseⅠ（Qiagen）處理去DNA。用Agilent 2000分析儀檢測RNA大小和完整性。采用PolyATract mRNA（Promega，Madison，WI，USA）分離純化mRNA。由反轉錄酶和隨機引物將片段化的mRNA合成cDNA第一鏈，第二鏈的合成則使用DNA polymerase Ⅰ和RNase H。用核酸外切酶和聚合酶進行末端修復、連接接頭，分離純化，PCR擴增創建cDNA文庫，采用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進行文庫質檢。

1.3 轉錄組分析

轉錄組測序采用Illumnima HiSeqTM2000，95 bp雙向測序。原始數據（Raw reads）通過去除接頭和低質量序列后，采用SOAPaligner/soap2將原始數據比對到斑馬魚基因組序列上，允許兩個以上堿基不匹配（Zebrafish genome assembly version 9，Zv9； http:// www.sanger.ac.uk）。比對完后，統計reads在參考序列上的分布及覆蓋度，判斷比對結果并進行質控。運用Trinity軟件（http://trinityrnaseq.sourceforge.net）進行組裝拼接，得到轉錄本序列。為了利于樣品間轉錄水平的比較，每個文庫標準化的基因表達水平用RPKM（Reads Per kilo-base per Million reads）表示。確定基因轉錄活性的閥值是基于每個基因RPKM值的95%置信區間。GO（Gene Ontology，基因聚類）功能注釋使用軟件Blast2GO（version 2.3.5）（http:// www.blast2go.org/）進行。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析使用帶ClueGO插件（http://www.ici.upmc.fr/cluego/cluegoDownload.shtml）的Cytoscape軟件（version 2.6.2）（http://www.cytoscape.org/）進行。樣本之間RPKM值變化倍數為2倍及以上的基因認為有差異表達。

1.4 實時定量PCR

為了驗證RNA測序結果，選取9個與繁殖相關的基因通過熒光實時PCR確定其在3個發育期（各1尾樣本）中的表達水平。本實驗在2014年圓口銅魚繁殖季節，自金沙江上游野外再采獲卵巢發育處于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的雌魚各一尾，作為實時熒光定量PCR驗證的樣品，提取總RNA?？俁NA用RevertAid ?First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）反轉錄合成cDNA第一鏈，引物采用oligo（dT）。PCR反應體系（20 μL）:SYBR綠色熒光染料Mix（Toyobo，Osaka，Japan）10 μL，引物0.25 μL，cDNA模板1 μL。選用glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapdh）作內參，計算mRNAs的相對表達量。檢測重復3次，每次設3個復孔，3次重復測量的值變異系數小于5%被認為有效。不同樣品的表達水平采用變化倍數（Mean±SE）來表示，設第Ⅲ期為對照，即第Ⅲ期樣品的值均設為1倍。實驗中引物設計見表 1。

2 結果

2.1 卵巢樣品的組織學特征

圓口銅魚的產卵主要是4或5齡雌性個體在4—5月或7月進行。在卵巢組織樣品的組織學特征觀察之后，選取樣品H6007、H6003和H5006用于之后的轉錄組研究。3個樣品的基本信息見表 2。所選取的每個圓口銅魚卵巢樣品的代表性顯微圖像見圖 1。卵黃生成期（Ⅲ期）的特點是卵黃明顯沉積，且周圍有大量油滴形成。卵母細胞成熟期（Ⅳ期）的特點是液泡逐漸消失，細胞質內卵黃增加，逐漸形成同質的細胞質。排卵期（Ⅴ期）特點是生發泡破裂（GVBD）及消失，切片觀察可發現染色的卵母細胞數量明顯減少。隨著卵巢的發育成熟，GSI也從2.1%增加到6.1%，這和其他關于硬骨魚類的研究結果是相符合的［8］。圓口銅魚所有卵母細胞的發育并非完全同步的，導致樣本在轉錄組分析中部分的發育階段分子特征發生重疊掩蓋，然而，隨著發育的進行，每個新的發育階段還是體現著顯著的組織學特征，相信各期所具有的獨特表達及組成會依然在轉錄組中有所體現。因此，選取的H6007（Ⅲ期）、H6003（Ⅳ期）和P5006（Ⅴ期）卵巢組織樣品作為轉錄組學分析對象，將能夠反映卵巢成熟各階段的表達特征。

表 1 實時定量PCR中引物信息Tab.1 Information on the primers that were used for quantitative real-time RT-PCR

表 2 轉錄組分析的圓口銅魚樣品基本信息Tab.2 Basic data on the three selected largemouth bronze gudgeon ovary samples

2.2 卵巢發育階段特異性轉錄組

為了了解圓口銅魚卵巢成熟的分子基礎，本研究對不同發育時期的卵巢樣品的轉錄組進行了比較。Trinity拼接得到47—151個轉錄本序列，其中共有35—255個轉錄本序列（74.8%）比對到斑馬魚參考序列中（E value < 1E-5）。3個轉錄組中，至少有一個RPKM值大于4的轉錄本序列有13—330個（顯著表達轉錄本），有11—495（86.2%）在斑馬魚參考基因組中有相應的基因描述。

圖 1 圓口銅魚卵巢主要發育期切片圖

通過對卵巢組織中的13330個顯著表達轉錄本的分析，我們發現在某一特定時期的基因表達特征與其相鄰時期最相似（圖 2），表明基因表達譜與卵巢形態發育密切相關。隨著卵巢發育的進行，差異表達的轉錄本數量也明顯不同。每個發育期表達的轉錄本數量venn圖（圖 2），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期卵巢共有9992個共同表達轉錄本，其中Ⅲ期和Ⅳ期卵巢共享11155個轉錄本，而Ⅲ期和V期則僅共享10299個轉錄本。如圖2所示，隨著卵粒的成熟，可檢測到的表達轉錄本數量逐漸減少，由Ⅲ期的12024、Ⅳ期的11832，至Ⅴ期的11172。

通過GO分析和KEGG通路分析，初步評估了參入性腺發育的主要生物學過程。不同樣本間發生最顯著影響的10個信號途徑GO和KEGG分析結果見表 3。這些通路分析結果進一步證實了圓口銅魚卵母細胞成熟過程與線粒體或細胞代謝、細胞成分合成相關，這與前人研究的其他硬骨魚類是相似的［9—11］。已有研究報道，Gai蛋白和細胞內cAMP參與孕酮介導的卵母細胞成熟過程［12］。生發泡破裂（GVBD）和細胞核位移過程中，Rho信號起重要作用［13—15］。而在爪蟾（Xenopus）卵巢中，促成熟因子（Maturation-promoting factor，MPF）復合體的激活包括細胞周期依賴性控制蛋白（cdc2，cyclin-dependent control protein 2）和細胞周期蛋白B1（cyclin B1），可調控卵母細胞成熟中生化過程的協調配合［16］。在3個樣品中，熱休克蛋白90（hsp90，heat shock protein 90）、cdc2，Ringo A和Mos Oocyte Mature Factor（mos）均有較高的表達量。圓口銅魚卵巢發育期后階段（Ⅴ期）上調的基因有，膜相關孕激素受體組件（Membrane-Associated Progesterone Receptor Component 2）、細胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白（cpe1，Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein 1）、Cyclin B1和Cyclin A。結果表明MPF和MOS相似的信號途徑在卵母細胞成熟過程中起作用。然而由于目前的KEGG軟件針對信號通路的分析過于強調病理生理過程，特別是腫瘤學研究，這種聚類分析不完全適合解釋卵巢發育過程中的轉錄組數據，因此，本研究后續利用所獲得轉錄組數據，進一步針對相關的內分泌信號分子的表達特征進行了分析。

圖 2 圓口銅魚卵巢發育過程中表達譜venn圖

2.3 內分泌和生長因子信號

圓口銅魚卵巢為非同步發育，相對于完全非同步發育的斑馬魚卵巢組織，在圓口銅魚卵巢中相對集中的不同發育時期的卵巢樣品是研究硬骨魚類卵子發生很好的模型。采用RNA-seq測序分析，與信號分子相關的內分泌/旁分泌因子在表 4中列出。從這些分子表達譜可以看出，哺乳動物和魚類卵巢的分子生物學過程有相似的基本特征。

表 3 不同卵巢樣品中差異表達基因的GO聚類分析Tab.3 Gene ontology（GO）analysis of differentially expressed genes in the different ovary samples

硬骨魚類類固醇激素，如熟知的促成熟激素（MIHs），能調控性腺分化、卵巢發育和卵母細胞成熟［17］。按照現有來自哺乳類或前人在硬骨魚類中的研究，假定圓口銅魚卵巢中關鍵的類固醇合成酶途徑見圖 3。那么本研究顯示在圓口銅魚卵巢成熟過程中，17β雌二醇的合成途徑始終是處于活動狀態。另外，前列腺素類，一組脂質類介質，包括前列腺素（PGs），在排卵過程中也起一定調控功能［18］?；赗NA-seq分析，在卵母細胞成熟階段，與前列腺素E（Prostaglandin E）合成相關的關鍵酶的表達量在卵巢發育Ⅳ是最高的，而前列腺素F的合成酶則在Ⅴ期達致最高（圖 4）。

2.4 圓口銅魚卵巢膽汁酸主要合成途徑

膽汁酸在脂質和膽固醇代謝過程中起著重要的作用，通常膽汁酸在肝膽系統中合成，在胃腸道起作用［19—21］。然而，本研究RNA-seq數據顯示，膽汁酸主要合成途徑中關鍵酶的轉錄本持續出現，如Cyp46A、Cyp7A、Cyp27A和Cyp8b（圖 5），與膽固醇合成相關的一些列關鍵酶的轉錄本在圓口銅魚卵巢中均有檢得，因此推斷硬骨魚類膽汁酸合成可能在卵巢中也發生。

2.5 實時定量PCR（RT-PCR）驗證RNA-seq結果

為了驗證RNA-seq分析中發現的一些關鍵內分泌信號分子的差異表達情況，共選取9個基因設計特異性引物，并采用另外獨立采集的3個不同成熟階段的樣本RNA進行驗證（表 1）。這些基因的動態表達特征，表明其可能參與卵巢發育成熟過程的調控。RT-PCR的結果顯示，這9個基因在不同時期表達水平的變化趨勢與RNA-seq結果相同，盡管表達量存在一定差異（圖 6）。

3 討論

作為分批產卵的魚類，圓口銅魚的卵巢在不同的發育階段中，都能觀察到異質性的卵巢組織，采取的卵巢樣品中，約有30%的卵母細胞處于卵黃形成期。與Ⅲ期樣本中卵母細胞群相比，Ⅳ期樣品中處于成熟期卵母細胞占約20%。而在Ⅴ期樣本的卵巢組織中則出現了超過10%處于排卵階段的卵母細胞。這些觀察表明，在野生圓口銅魚的卵巢發育過程中，進入后期成熟過程的卵母細胞僅占一部分，即使在出現了超過10%的卵母細胞達致成熟排卵期時，依然有發育至各期的卵母細胞在卵巢中存在，表明圓口銅魚的群同步性成熟特征。因此也表明我們所選取的樣品都將發生各個發育期存在部分重疊的分子特征。然而，我們假定每個新出現階段的分子特征是可區別的，并且能夠反映增加的和疊加的基因表達譜。同時，我們采用的整體卵巢組織取樣，也將真實地反映性腺成熟的實際發生過程，包含與生殖細胞交流中的來自生殖腺中的體細胞表達特征。

表 4 卵巢樣品中與內分泌信號相關的差異表達基因Tab.4 Differentially expressed genes related with endocrine signaling genes in the ovary samples

圖 3 圓口銅魚卵巢性腺類固醇激素表達變化

圖 4 圓口銅魚卵巢與性腺廿烷酸合成相關的基因表達變化

圓口銅魚和斑馬魚都同屬于鯉科魚類［22］，由于沒有圓口銅魚全基因組信息，以斑馬魚基因組為參考序列，生物信息學分析顯示圓口銅魚轉錄本表達水平RPKM值大于4的轉錄本有86.2%是與斑馬魚轉錄本高度匹配的，表明我們的分析具有較高的可信度?；贕O聚類分析的KEGG通路分析揭示，圓口銅魚卵巢樣品中差異表達的轉錄本的信號途徑包含:卵巢能量代謝、Gαi信號、胞內cAMP驅動信號和孕酮介導的卵母細胞成熟等與形態變化高度相關的信號途徑［12，14—16］。這些觀察到的卵巢成熟特征與爪蟾和其他魚類的前期報道具有共有特征，因此，本研究的RNA-seq和GO分析具有較強的功能分析的可信度。

3.1 內分泌和生長因子信號

內分泌/自分泌信號是機體調控生殖過程的重要信號網絡，也是體外可能對圓口銅魚養殖過程中人工催熟雌魚實施干預的理論基礎，因此，本次分析主要聚焦圓口銅魚卵巢組織中內分泌/自分泌信號分子的表達特征。和其他脊椎動物一樣，硬骨魚類卵母細胞的生長、成熟及排卵過程受到卵巢外信號和卵巢濾泡內部因子的雙重調控，這些因子包括垂體分泌的一些多肽類激素，如促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）和催乳素（PRL）［1，23］。這些垂體促性腺激素可以通過循環系統運載至性腺組織，由在該處表達的受體感應從而接受垂體激素的調控，另外來自垂體等中樞內分泌器官的促性腺激素也可以通過調控由身體其他部位，包括性腺組織的類固醇激素生成代謝而間接調節卵泡的發育。例如，有研究表明促卵泡激素（FSH）能夠促進卵泡產生17β-雌二醇，后者能夠促進卵黃形成和卵母細胞成熟［17］。除了雌二醇外，一些轉化生長因子（TGFβ）超家族成員對調控卵母細胞發育和成熟也起重要作用。TGFβ超家族成員主要包括生長分化因子9（GDF9）、骨形態發生蛋白15（BMP15，bone morphogenetic protein 15）、激活素（Activin）、抑制素（Inhibin）和抗苗勒氏管激素（AMH）。以及針對活化素發生抑制作用的TGFβ家族信號的關聯分子卵泡抑制素（Follistatin），許多屬于TGFβ的信號途徑可以活躍地參入對卵巢發育的調節［24—27］。一些其他激素和生長因子，如生長激素類胰島素生長因子（IGFs）和表皮生長因子（EGF）也被報道在調節卵巢成熟中起作用［28，29］。從圓口銅魚的分子表達譜可以看出，魚類卵巢和哺乳動物的分子生物學過程有相似的基本特征。

圖 5 圓口銅魚卵巢中與膽固醇和膽汁酸合成相關的基因表達

3.2 雌激素信號

我們發現圓口銅魚卵巢成熟過程中，FSH受體的表達量低，且隨著發育進程逐漸降低，表明FSH主要在卵巢成熟的早期起作用，有報道表明FSH促進竇卵泡發育，在卵母細胞生長時作用停止［1］。此外，在圓口銅魚卵巢樣品中prl受體的表達量處于相當平穩的水平，有研究報道IGFs（Insulinlike growth factors）與卵泡發育密切相關［11］，而我們也發現igf-2和igf受體以及一些IGF結合蛋白基因（igfbps，IGF-binding protein genes）在圓口銅魚卵巢成熟過程中均有表達。令人意外的是我們未發現lh受體在成熟過程中的卵巢組織有明顯表達，其原因值得探究。

在正常情況下，卵母細胞的成熟過程依賴于卵母細胞和卵泡顆粒細胞間一系列的信號分子的相互溝通和協調。卵母細胞通過合成和分泌卵母細胞特異性因子直接調控其發育及卵泡的生長和分化，如GDF-9和BMP15作用于卵泡顆粒細胞，改變其增殖、功能和分化。研究表明GDF-9缺陷的小鼠（C56BL/6）卵母細胞生長加速，可推斷GDF-9參與負反饋調控途徑，緩和卵母細胞生長［30］。BMP-15缺失的綿羊（Ovis aries），卵泡發育至第一階段即停止發育，卵母細胞迅速從有活力的卵泡中消失［31］。在本研究中，檢測到圓口銅魚卵巢中gdf-9和bmp15有一定的表達量，且gdf-9的表達水平在排卵期顯著上升（圖 6）。這表明硬骨魚類和哺乳動物可能采用的相似的方式，都是通過卵母細胞中gdf-9和bmp15表達水平的時空變化來調控卵母細胞成熟。激活素與抑制素是TGFβ超家族中兩個緊密相關的信號成員，具有相反的生物學功能。激活素能夠加強FSH的生物合成和分泌，并參與調節卵母細胞的成熟。卵泡抑素（Fst，Follistatin）不是TGFβ超家族成員，但屬于一種激活素結合蛋白，能夠抵消激活素活性。在斑馬魚及其他許多脊椎動物卵巢中，卵母細胞發育早期激活素信號網絡顯著高表達，成熟過程中逐漸下降，然而在排卵期又急劇上升。有報道激活素、抑制素和Fst在斑馬魚卵巢顆粒細胞中表達［27］。然而，激活素、抑制素和Fst轉錄本在本次研究的圓口銅魚卵巢中未檢測到，一些激活素受體基因和Fst-like-1的表達卻能觀察到。有趣的是，圓口銅魚卵巢中激活素Ⅱ型受體（A c t i v i n typeⅡreceptor）的表達量在排卵期顯著下降。這些觀察結果表明，圓口銅魚卵母細胞成熟過程中包含一個類似激活素信號的調節效應。AMH是TGFβ超家族另一成員，在小鼠卵巢原始卵泡增殖和優勢卵泡選擇中起重要作用［24，25］。在本研究中，amh在圓口銅魚卵巢卵黃形成期有適度表達，在其他時期均處于較低的表達水平（圖 6）。這種amh表達量的動態變化可能暗示其在卵母細胞成熟早期階段一起作用。

圖 6 卵巢成熟過程中關鍵內基因分泌信號轉錄本的RT-PCR驗證結果

在硬骨魚類卵母細胞生長和成熟過程中，類固醇激素，尤其是雌二醇-17β（Estradiol-17β），通過控制肝臟中卵黃蛋白原的合成來調控卵巢的發育。卵巢為雌二醇-17β合成的主要部位，合成過程受到下丘腦-垂體-性腺軸的調控。estradiol-17β是一種天然的類固醇激素，在卵巢中由膽固醇合成而來［1，17］。魚類膽固醇的合成途徑見圖 5。如圖 5所示，關鍵酶的相對表達量，包括限速HMG CoA還原酶在內，在所檢測的三個時期中表現出相當穩定的表達水平，這表明在其卵巢成熟各階段能合成足夠豐富的膽固醇資源。而由膽固醇生成雌二醇17β過程中（圖 3），需要的所有關鍵酶轉錄本均有檢測到，只有cyp11a和cyp19a1a的表達水平在三個樣品中相對較低。圓口銅魚卵巢中沒有發現cyp11b、cyp21a和hsd17b3轉錄本，表明在圓口銅魚中并非依賴11-脫氧皮質酮作為其主要的促生素激素（MIH）作用，此次檢測也未發現在圓口銅魚卵巢中睪丸酮合成途徑的存在。這些結果表明，17α，20β-雙羥孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one）可能是圓口銅魚卵母細胞成熟過程中主要的促成熟激素。盡管合成雌二醇17β關鍵酶的表達水平并沒有發育時期特異性，但是類固醇合成因子1a（sf-1a，steroidogenic factor 1a）和雌激素相關受體α（errα，estrogen-related receptor α）表達水平在圓口銅魚卵巢排卵期顯著下降。而且，磺基轉移酶家族2（sf 2，sulfotransferase family 2）是雌二醇17β代謝的主要代謝酶［32，33］，其表達水平在排卵期卵巢中顯著高表達（圖 4、圖 6）。這些結果表明，在圓口銅魚卵巢中，雌二醇17β的活性在排卵期可能是下調的。

3.3 雄激素信號

在魚類卵巢中，前列腺素（PGs）可由廿碳四烯酸（Arachidonic acid）合成。在雌性繁殖過程中，前列腺素被認為是一種重要的中介物質。前列腺素氧化環化酶2（Ptgs2，Prostaglandin-endoperoxide synthase 2； 又名環氧化酶-2，COX-2），能將廿碳四烯酸轉化成內過氧化物PGH2，是卵泡中前列腺素合成的限速酶［18，34］。如圖 4所示，PGE2合成途徑中的所有關鍵酶都具有相當高的表達水平，而且一些合成酶的轉錄水平，包括限速酶cox-2在內，在卵母細胞成熟期升高（圖 4、圖 6）。PGE2生成的階段特異性可能表明其活躍地參與圓口銅魚的卵巢成熟過程的調節。

3.4 膽汁酸合成因子

膽汁酸是一種類固醇物質，主要在肝臟中由膽固醇合成。膽汁酸有兩條合成途徑，經典途徑（肝臟）和替代途徑（肝外型），已有研究表明這兩條合成途徑在人類卵巢中均存在［2 0］。圓口銅魚卵巢KEGG分析表明，在卵巢中存在著膽汁酸合成的兩種主要途徑的所有關鍵酶轉錄本，且沒有階段特異性（圖 5）［19—21］。這是首次發現在魚類卵巢中有膽汁酸的合成，然而，膽汁酸在卵泡中生成的生理學功能有待進一步研究。

利用消減雜交［9，35，36］和寡核苷酸基因芯片［10，11，37］技術，已經對一些硬骨魚類進行了與階段特異性的卵巢成熟相關的差異基因表達譜研究。然而，RNA測序是進行全轉錄組分析的新標準，相比目前的轉錄組學分析，全mRNA測序展現出更高的準確性和可重復性［7］。迄今為止，還沒有關于利用轉錄組測序對硬骨魚類卵巢進行分期進行差異基因表達分析的報道。本文利用RNA測序技術對野生的圓口銅魚卵巢成熟過程進行表達譜分析，并主要聚焦于圓口銅魚卵巢成熟過程的內分泌/自分泌調控因子，并概括了在卵巢成熟過程中的這些信號的動態表達特征（圖 7）。本研究觀察為指導圓口銅魚的卵巢發育的內分泌干預方式提供了依據，一些動態表達的轉錄本也具有作為識別卵巢發育階段和卵子獲得受精能力的潛在特征性分子標記。

圖 7 圓口銅魚卵巢成熟過程中重要內分泌/自分泌信號基因的動態表達

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ENDOCRINE GENE EXPRESSION PATTERNS ASSOCIATED WITH THE OVARIAN MATURATION OF WILD FEMALE LARGEMOUTH BRONZE GUDGEON（COREIUS GUICHENOTI）

XIA Yu-Guo1，2，CHEN Xiao-Wen1，HE Jiang-Yan1，LIU Jia-Shou1and YIN Zhan1
（1.The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract:Oocyte maturation in fish involves numerous cell signaling cascades，including complex regulation by a set of endocrine/autocrine factors during specific stages of oocyte development.Wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）in the Yangtze River，which are group-synchronous reproducers，provide an opportunity to characterize the features associated with each emerging stage during the process of ovary development.This study reports the transcriptome profiling analysis of wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）ovaries at various morphologically diverse stages using the powerful RNA-seq approach.Our RNA-seq analysis identified 11495 contigs with definite gene description according to the zebrafish genome.Focusing on the endocrine/autocrine signaling pathways involved in oocyte maturation and ovulation，the expression profiles of the genes involved in the sensing cascade and metabolism pathways of various hormones and growth factors，such as prolactin（PRL），follicle-stimulating hormone（FSH），estrogen，prostaglandin E2（PGE2），growth/differentiation factor 9（GDF9），activin，and anti-Müllerian hormone（AMH），were analyzed.Our results indicate an overall conservation of the components and transcriptome alterations underlying oocyte maturation in fish and other vertebrate models.The transcriptional profile also suggests that 17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one and not 11-deoxycorticosteron may be synthesized as the maturation-inducing hormone in largemouth bronze gudgeon.The transcripts of the complete set of genes associated with the primary bile acid synthesis pathway in the fish ovary were also observed.This transcriptome profiling analysis provides valuable information regarding thousands of transcripts involved in the ovulation of wild largemouth bronze gudgeon.Because this fish is a wild group-synchronous spawner，the results obtained in our study also revealed insights into the cascades of endocrine regulatory events underlying fish oocyte maturation.

Key words:Coreius guichenoti； Ovarian maturation； Transcriptome analysis； Endocrine/autocrine signals

中圖分類號：Q344+.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0431-12

doi:10.7541/2016.58

收稿日期：2015-05-05；

修訂日期：2015-07-23

基金項目：國家科技支撐計劃基金項目（No.2012BAD25B08）； 三峽集團研究項目（CT-12-08-01）資助［Supported by the National Key Technology R&D Program of China（No.2012BAD25B08）； Research Project of China Three Gorges Corporation（CT-12-08-01）］

作者簡介：夏雨果（1988—），女，湖北人； 博士研究生； 主要從事魚類生態學和魚類資源學研究。E-mail:xiayg@ihb.ac.cn

通信作者：殷戰，zyin@ihb.ac.cn； 劉家壽，jsliu@ihb.ac.cn