沉默GRP94基因?qū)θ橄侔㎝CF7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

樊建軍　武家燕　李　韻　曾　帆　宋方洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶400016)

沉默GRP94基因?qū)θ橄侔㎝CF7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

樊建軍武家燕李韻曾帆宋方洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶400016)

[摘要]目的：研究沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94 (Glucose regulated protein，GRP94)對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖、凋亡的影響及潛在機(jī)制。方法：設(shè)計(jì)并化學(xué)合成靶向沉默GRP94基因的小干擾RNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入MCF7細(xì)胞中，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)GRP94、cyclinD1、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例變化，Hoechst 33258染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞核變化、CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果：GRP94 siRNA組GRP94基因的表達(dá)水平被有效抑制；與對(duì)照組相比，GRP94-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡比例明顯增加；凋亡細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化；增殖能力明顯下降；mRNA及蛋白水平cyclinD1、Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，Bax表達(dá)增加。結(jié)論：沉默GRP94基因可明顯抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且其可能通過(guò)下調(diào)cyclinD1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達(dá)參與其中。

[關(guān)鍵詞]GRP94基因；MCF7細(xì)胞；增殖；凋亡

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性身心健康的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤第二位，近幾年在我國(guó)其發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)[1]。研究表明乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，其中許多重要基因參與其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，已報(bào)到cyclinD1、MMP9等基因的異常表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生[2,3]，因此針對(duì)乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因靶向進(jìn)行研究，有助于進(jìn)一步揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后。

分子伴侶GRP94作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的豐度蛋白之一，參與了蛋白質(zhì)的組裝、折疊與降解，同時(shí)可與Ca2+離子結(jié)合參與細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[4]。研究表明，GRP94在食管癌、胰腺癌及子宮癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)趨勢(shì)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。有學(xué)者在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GRP94呈高表達(dá)趨勢(shì)[6]，沉默GRP94可有效抑制腫瘤的侵襲遷移能力，提示腫瘤中高表達(dá)的GRP94對(duì)于腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處遷移能力的獲得具有重要作用[7]。為了進(jìn)一步研究GRP94與乳腺癌生物學(xué)特性的關(guān)系，本研究采用小干擾RNA技術(shù)靶向沉默乳腺癌MCF7細(xì)胞中GRP94的表達(dá)，觀察其對(duì)MCF7細(xì)胞增殖及凋亡的影響并探討其可能機(jī)制，進(jìn)而為研究GRP94在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑PRMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Total RNA 提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineRNAIMAX購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；蛋白提取試劑盒、β-actin單克隆抗體和ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；各引物由上海生工生物公司合成；兔抗人GRP94、cyclinD1單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；兔抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自CST公司。

1.2方法

1.2.1siRNA的合成根據(jù)GRP94基因在Genebank中的序列(Genebank Accession No:NM-003299.2設(shè)計(jì)靶向GRP94基因的siRNA序列：(UACUGUACCAUCCACAUCA)；siRNA-negative control序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，干粉siRNA用DEPC水稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存。由含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 h，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合度時(shí)，參照LiopfectamineRNAIMAX產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，分別將siRNA-NC和siRNA-GRP94轉(zhuǎn)染至六孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。

1.2.3qRT-PCR法收集轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞，按照Total RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，再分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green法進(jìn)行qRT-PCR，用于擴(kuò)增各目的基因cDNA片段的引物見(jiàn)(表1)，反應(yīng)條件為：95℃、3 min；95 ℃、5 s；60 ℃、15 s；72 ℃、15 s，共39個(gè)循環(huán)。同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4Western blot法分別收集轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液100℃，5 min，每孔40 μg，80 V恒壓SDS-PAGE電泳，250 mA恒流2 h冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(GRP94 1∶1 000、cyclinD1 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶500、β-actin 1∶3 000)4 ℃過(guò)夜，次日TBST漂洗5 min×5次，加入HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔1∶4 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×4次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.5CCK-8法將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞分別消化收集，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔3 000個(gè)/100 μl接種于96孔板中，以細(xì)胞貼壁后計(jì)為1 d，分別在1、2、3、4、5 d不同時(shí)間段加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育2 h后在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)其光密度值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)消化收集轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡比例變化的檢測(cè)按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，消化收集各組轉(zhuǎn)染72 h的各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5min，棄去上清液，PBS洗滌并重懸，先后加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI各在4 ℃孵育15 min后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7Hoechst 33258染色將對(duì)數(shù)增殖期MCF7細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/孔提前24 h接種于放有玻片的12孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，去除培養(yǎng)基，加入1 ml 4%多聚甲醛，室溫固定30 min，后去除固定液，PBS漂洗3次，5 min/次，晾干后每孔加入100 μl Hoechst 33258液，室溫染色10 min，PBS漂洗3次，10 min/次，去除多余水分，使用抗熒光猝滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照。

2結(jié)果

2.1qRT-PCR、Western blot分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證GRP94siRNA沉默效果結(jié)果顯示：siRNA-NC組中GRP94基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于siRNA- GRP94，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、B)說(shuō)明GRP94基因被有效沉默。

2.2沉默GRP94對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖能力的影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞貼壁后1、2、3、4、5 d的光密度值，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示與siRNA-NC相比，siRNA-GRP94組中細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯下降，說(shuō)明沉默GRP94對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

表1引物序列

Tab.1Sequences for primers

GenenamePrimersequenceGRP94Forward5'-GGGAGGTCACCTTCAAGTCG-3'Reverse5'-GGGTGTAGACGTGGAGCTC-3'CyclinD1Forward5'-AAGCTGTGCATCTACACCGA-3'Reverse5'-CTTGAGCTTGTTCACCAGGA-3'BaxForward5'-GGCGAATTGGAGATGAACTG-3'Reverse5'-TGCCATCAGCAAACATGTCA-3'Bcl-2Forward5'-ATCCAGGATAACGGAGGCTG-3'Reverse5'-CAGGTATGCACCCAGAGTGA-3'β-actinForward5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'Reverse5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'

2.3沉默GRP94對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果顯示：沉默GRP94基因表達(dá)后，與siRNA-NC組相比siRNA-GRP94組中細(xì)胞凋亡比例明顯增加(圖3A)(P<0.05);Hoechst 33258 染色后siRNA-GRP94組中細(xì)胞熒光顯微鏡下，細(xì)胞核發(fā)生明顯變化，染色質(zhì)凝集，邊緣化的細(xì)胞量顯著增加(圖3B)。提示沉默GRP94促進(jìn)MCF7細(xì)胞凋亡。

2.4沉默GRP94對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞中cyclinD1、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-GRP94組中cyclinD1、Bax表達(dá)明顯減少，Bcl-2表達(dá)明顯增加差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默GRP94表達(dá)可有效抑制cyclinD1、Bax表達(dá)，且上調(diào)Bcl-2表達(dá)(圖4、5)。

圖1　qRT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP94 mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.1　Expression of GRP94 mRNA and protein level was detected by qRT-PCR and western blotNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05,compare with RNA-NC group.

圖2　CCK-8測(cè)定沉默GRP94基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖的影響Fig.2　Effect of silencing GRP94 expression was evaluated by CCK-8 on the cell proliferation of MCF7 cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01 compare with siRNA-NC group.

圖3　沉默GRP94基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響Fig.3　Effect of silencing GRP94 expression was detected by flow cytometry and hoechst 33258 staining on cell apoptosis of MCF7 cellsNote: A.Flow Cytometry assay；B.Hoechst 33258 Staining;*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

圖4　沉默MCF7細(xì)胞中GRP94基因?qū)yclinD1表達(dá)的影響Fig.4　Effects of silencing GRP94 on expression of cyclinD1 in MCF7 cellsNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

圖5　沉默GRP94基因表達(dá)對(duì)MCF7細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig.5　Effects of silencing GRP94 on expression of Bax and Bcl-2 in MCF7 cellsNote: A.mRNA level;B.protein level;*.P<0.05，compare with siRNA-NC group.

3討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多層次、多階段演進(jìn)的過(guò)程，其涉及到多種因子的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)也與眾多信號(hào)通路的異常活化密切相關(guān)[8]。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，由于腫瘤細(xì)胞處于缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良等微環(huán)境中，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白增多，進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR),GRP94表達(dá)被誘導(dǎo),協(xié)助未折疊蛋白的折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)GRP94可通過(guò)影響多條信號(hào)通路的活化參與腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程[10]，且與腫瘤細(xì)胞的耐藥性的獲得密切相關(guān)[11]。Hua等[12]在一項(xiàng)多發(fā)性骨髓瘤的研究中發(fā)現(xiàn),分子伴侶GRP94通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而通過(guò)選擇性抑制劑WS13處理后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Chen等[12]通過(guò)對(duì)小鼠肝臟特異性敲除模型的研究發(fā)現(xiàn)，GRP94可選擇性激活ERK信號(hào)通路，參與腫瘤的發(fā)生。張黎川等[11]證實(shí)上調(diào)GRP94表達(dá)可提高肺癌SK-MES-1細(xì)胞對(duì)VP-16的耐藥性。提示GRP94與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而針對(duì)分子伴侶GRP94的研究對(duì)探討實(shí)體瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要的實(shí)用價(jià)值。

本研究在乳腺癌MCF7細(xì)胞中采用RNAi技術(shù)外源性導(dǎo)入靶向GRP94的siRNA，結(jié)果顯示mRNA與蛋白水平GRP94表達(dá)均顯著降低，提示MCF7細(xì)胞中GRP94表達(dá)被顯著抑制。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，沉默GRP94表達(dá)后細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡比例明顯增加，提示GRP94參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡的發(fā)生。細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)主要定位于細(xì)胞核，其表達(dá)具有嚴(yán)格的周期順序性，研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1作為Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生理過(guò)程，且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。沉默GRP94表達(dá)后發(fā)現(xiàn)cyclinD1明顯降低，提示沉默GRP94可能通過(guò)影響cyclinD1表達(dá)調(diào)控乳腺癌MCF7細(xì)胞的增殖能力。而進(jìn)一步我們推測(cè)沉默GRP94可能通過(guò)阻斷Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌MCF7細(xì)胞的增殖能力。Bax與Bcl-2作為Bcl-2家族重要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白，腫瘤中Bcl-2/Bax表達(dá)比例決定著細(xì)胞幸存還是凋亡[15]。沉默GRP94表達(dá)后，結(jié)果顯示Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)明顯增加，細(xì)胞凋亡發(fā)生，提示沉默GRP94可通過(guò)影響B(tài)cl-2/Bax表達(dá)比例，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。而GRP94如何介導(dǎo)這一過(guò)程的發(fā)生，有待于我們進(jìn)一步的研究。

綜上所述，乳腺癌中高表達(dá)的GRP94參與了腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制凋亡的發(fā)生，提示GRP94對(duì)乳腺癌的發(fā)生與惡化起著重要的作用，而其是否可作為乳腺癌的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制研究是我們今后的研究重點(diǎn)，而本研究以GRP94基因?qū)θ橄侔㎝CF7細(xì)胞增殖與凋亡的影響作為切入點(diǎn)，為乳腺癌的基因治療靶點(diǎn)的探索提供理論基礎(chǔ)。

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[收稿2015-09-10修回2015-06-01]

(編輯許四平)

Effect of GRP94 silencing on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma MCF7 cells

FAN Jian-Jun,WU Jia-Yan,LI Yun,ZENG Fan,SONG Fang-Zhou.

Department of Biochemistry and Molecular Biology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

[Abstract]Objective:To determine the effects of silencing glucose regulated protein (GRP94) on the proliferation and apoptosis of breast carcinoma MCF7 cells.Methods: Chemically synthesized siRNA targeting GRP94 gene and transfected into MCF7 cells used by Liopfectamine RNAIMAX.The mRNA and protein expression levels of GRP94,cyclinD1,Bax and Bcl-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.CCK8 assay was used to detect the effect of specific GRP94 siRNA on cell proliferation and the effect on cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry and Hoechst 33258 staining.Results: Compared with the siRNA-NC cells,the expression of GRP94 was significantly down-regulated in MCF7 cells.Knockdown of GRP94 in MCF7 cells decreased cell proliferation and promoted cell apoptosis.The expression of cyclinD1and Bcl-2levels were significantly reduced,and Bax level was increased in siRNA-GRP94 MCF7 cells.Conclusion: The siRNA-mediated GRP94 silence significantly inhibits MCF7 cell proliferation，promoted cell apoptosis by down-regulating cyclin D1,Bcl-2 expression and up-regulating the Bax expression in MCF7 cells.

[Key words]GRP94 gene;MCF7 cells;Proliferation;Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.013

作者簡(jiǎn)介：樊建軍(1986年-)，男，碩士，主要從事腫瘤生物學(xué)、腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)研究,E-mail:steve4802@163.com。 通訊作者：宋方洲 (1956年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，華中科技大學(xué)兼職博導(dǎo)，主要從事細(xì)胞與分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)、基因工程藥物與基因治療方面的研究,E-mail:fzsongcq@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)R392.12R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0828-04