SIRT1抑制劑sirtinol對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制

張大田　石建國(guó)　張　強(qiáng)　劉　巖

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧　錦州　121001)

SIRT1抑制劑sirtinol對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制

張大田石建國(guó)張強(qiáng)劉巖

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的觀察SIRT1抑制劑sirtinol對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子(Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3)表達(dá)變化的影響，探討SIRT1在前列腺癌發(fā)生的可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)DU145細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(DMSO組)和sirtinol組(終濃度為10，25和50 μmol/L)，Western 印跡檢測(cè)DU145細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western 印跡檢測(cè)DU145細(xì)胞中細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，隨著sirtinol濃度的增加，SIRT1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，細(xì)胞凋亡比例增加，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后Bcl-2蛋白表達(dá)減少，且隨劑量增加表達(dá)越低；Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比率降低；伴隨Cytochrome C的釋放和Caspase-3的激活。結(jié)論下調(diào)SIRT1表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DU145細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與改變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕SIRT1；sirtinol；前列腺癌；DU145；細(xì)胞凋亡

前列腺癌發(fā)生是一個(gè)多因素和多階段的復(fù)雜過(guò)程，隨著與前列腺癌密切相關(guān)的癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，前列腺癌的發(fā)病機(jī)制逐漸闡明〔1，2〕；前列腺在體內(nèi)位置比較表淺，基因治療藥物可直接安全通過(guò)腔內(nèi)注射到病灶使前列腺癌的基因治療成為研究熱點(diǎn)〔3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白去乙酰化酶〔4〕，它通過(guò)去乙酰化修飾組蛋白和眾多的非組蛋白(STAT3、p53、FOXO家族等)維持染色質(zhì)的沉默和基因組穩(wěn)定并參與調(diào)控細(xì)胞的能量代謝、凋亡、衰老、腫瘤和神經(jīng)退行性病變等體內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程〔5～7〕。SIRT1在不同的腫瘤類(lèi)型中表達(dá)相差甚遠(yuǎn)，SIRT1在人前列腺癌、結(jié)腸癌、急性髓細(xì)胞白血病等腫瘤中高表達(dá)，而在膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤和卵巢癌中的表達(dá)明顯受抑制〔8,9〕。前列腺癌中SIRT1的作用在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道也不盡相同〔2,3〕，因此本研究使用不同濃度的SIRT1抑制劑sirtinol作用前列腺癌細(xì)胞DU145，探討下調(diào)SIRT1表達(dá)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系凋亡的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器sirtinol〔S8825,≥98% (HPLC)，Sigma公司〕；DMEM培養(yǎng)液(Corning公司)；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Mbchem公司)；SIRT1和Bcl-2(鼠單克隆抗體，Merck Millipore公司)、Bax、Caspase-3(兔單克隆抗體,CST公司)、Cytochrome C(兔單克隆抗體，Abcam公司)、β-actin抗體(兔多克隆抗體，Santacruz公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology公司)；Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)；BB16UV CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ 40B型(北京六一儀器廠)；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組人前列腺癌細(xì)胞DU145購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，飽和濕度、37℃和5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時(shí)0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以1×105/ml濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中或96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后給藥，sirtinol組終濃度分別為10、25和50 μmol/L，對(duì)照組加入5 μl DMSO〔DMSO濃度小于0.1%(V/V)，此濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響〕。

1.3倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞24 h或48 h后取出培養(yǎng)瓶，于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)特征。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡DU145細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的sirtinol干預(yù)SIRT1的活性，上述細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，換用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶-EDTA消化，離心各種處理的細(xì)胞，無(wú)菌PBS液洗滌2次；加入FITC-annexin和100 μg/ml PI染液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，室溫孵育 15 min，各組細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，CellQuest 分析軟件分析各組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例。

1.5Western 印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)蛋白裂解液提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白， BCA法測(cè)定蛋白濃度，-20℃或-80℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪厩埃尤?×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，含5%BSA的TBST(pH7.4)室溫?fù)u動(dòng)2 h封閉濾膜，取出后的濾膜分別與SIRT1，Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase-3及β-actin(稀釋比為1∶1 000) 4℃溫育過(guò)夜。TBST洗滌3次，HRP耦聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜后， ECL發(fā)光顯色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Graphpad prism 5軟件，行方差分析。

2結(jié)果

2.1sirtinol對(duì)DU145細(xì)胞形態(tài)特征的影響對(duì)照組的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)梭形，大小較均一，細(xì)胞呈半透明狀，生長(zhǎng)速度較快；經(jīng)sirtinol作用后，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞內(nèi)有空泡形成，大小不一，折光性變差，懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片增加。

2.2SIRT1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)與對(duì)照組相比，隨著sirtinol濃度的增加，SIRT1蛋白表達(dá)水平逐漸降低(圖1)。

1～4:0、10、25、50 μmol/L sirtinol圖1　不同濃度sirtinol處理 DU145細(xì)胞后SIRT1蛋白表達(dá)水平

2.3sirtinol對(duì)DU145細(xì)胞凋亡影響對(duì)照組有大量活細(xì)胞，不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后，隨著藥物濃度的升高，凋亡細(xì)胞所占比例逐漸增加(P<0.01)，但sirtinol濃度增加到50 μmol/L時(shí)，壞死細(xì)胞也明顯增加。10～25 μmol/L sirtinol處理后大量活細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，但死亡細(xì)胞的數(shù)量變化不大。而細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L sirtinol作用后，壞死細(xì)胞增加明顯。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度sirtinol處理 DU145細(xì)胞后

與0 μmol/L sirtinol組比較：1)P<0.01

2.4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，各sirtinol濃度組DU145細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少，且隨劑量增加表達(dá)減少；Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比率降低；伴隨大量Cytochrome C的釋放和Caspase-3的激活(圖2)。

1～4:0、10、25、50 μmol/L sirtinol圖2　不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)

3討論

本研究結(jié)果說(shuō)明sirtinol可以改變內(nèi)源性SIRT1表達(dá)，表明SIRT1與DU145細(xì)胞增殖密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡也稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，是各種因素觸發(fā)細(xì)胞死亡程序而引起的細(xì)胞主動(dòng)性死亡。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、器官生成、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文結(jié)果表明，活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度(PI/AV)，早期凋亡細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)綠色熒光(PI/AV+)，晚期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)極強(qiáng)的綠色熒光(PI+/AV+)，壞死細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色(PI+/AV)。和對(duì)照組相比，sirtinol處理后增加細(xì)胞凋亡比例，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。線(xiàn)粒體凋亡途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的細(xì)胞凋亡信號(hào)〔10〕。Bcl-2家族參與線(xiàn)粒體凋亡途徑的起始引發(fā)，其中Bcl-2，Bcl-XL和Mcl-1是主要的抗凋亡因子，且均能抑制Cytochrome C的釋放，使其無(wú)法激活下游Caspase，保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡。而B(niǎo)cl-2家族中的Bax，Bak，Bik和 Bid是促凋亡蛋白，引起Cytochrome C的釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔11〕。本文結(jié)果表明Bcl-2 家族中凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比率變化是sirtinol作用DU145細(xì)胞后引發(fā)的凋亡。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)sirtinol作用DU145細(xì)胞后有大量Cytochrome C的釋放和caspase-3的激活，這與Lee等〔12〕人的報(bào)道相一致。以上結(jié)果表明，sirtinol引起的DU145細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)線(xiàn)粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的。

綜上，本研究證實(shí)下調(diào)內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與改變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的表達(dá)相關(guān)，提示SIRT1在前列腺癌的發(fā)生中可能扮演癌基因的角色。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(2011225015)

通訊作者：劉巖(1976-)，男，副教授，碩士，主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤生物學(xué)研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R581.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2599-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.013

第一作者：張大田(1969-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事泌尿腫瘤生物學(xué)研究。