葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS?1193T〉C與3′?UTR的多態性探討

林芬　楊輝　吳教仁　楊立業

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葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS?1193T〉C與3′?UTR的多態性探討

林芬楊輝吳教仁楊立業

［摘要］目的對中國人群葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（glucose?6?phosphate dehydrogenas，G6PD）c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性與3′?非翻譯區（3′?untranslated regions, 3′?UTR)的多態連鎖相關性進行研究。同時了解粵東、華北地區健康人群中該突變基因的攜帶情況。方法應用全自動生化儀速率法測定G6PD活性，基因測序檢測G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性。根據G6PD基因UTR區設計特異性引物，測序確證攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性的G6PD缺乏標本是否連鎖有UTR單個堿基上的變異（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點的變異。結果華南地區有39 例G6PD缺乏樣本檢測到攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變，其3′?UTR和5′?UTR端沒有檢測到SNP位點的變異。同時，我們研究發現G6PD酶活性正常的人群中也攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C變異，其在潮州、梅州各100名正常人群中發生率分別為15.7%和12%，在鄭州和石家莊各50名正常人群中發生率分別為2%和8%。該變異在中國南方與北方的正常人群之間相比較有統計學差異。粵東地區G6PD缺乏者中攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變的樣本并未發現連鎖有UTR SNP位點突變。結論關于G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變與G6PD缺乏之間的相關性值得進一步探討。

［關鍵詞］G6PD缺乏癥；基因突變；UTR

作者單位：南方醫科大學附屬潮州市中心醫院中心實驗室，廣東，潮州521021

葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（glucose?6?phosphate de?hydrogenas，G6PD）缺乏癥的發病原因主要是G6PD基因突變，導致G6PD酶活性降低，紅細胞受氧化損傷而遭到破壞，引起溶血性貧血。臨床表現高度異質性，其溶血的嚴重程度與剩余酶的功能呈負相關［1-3］。我們在臨床研究中發現，粵東地區G6PD缺乏的病例中常發現2種靜止突變，外顯子c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C顯示出強連鎖，而這種病例未發現其它外顯子的突變。不久前，國外研究者指出c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C2種靜止突變與其下游非轉錄區的一個單個堿基上的變異（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點連鎖，這個位點的基因突變導致了基因表達（mRNA）降低［4］，從而引起G6PD缺乏。中國人群中攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏者是否也連鎖有SNP位點的變異？目前無文獻報告。另外，也有少數研究報道在G6PD正常的人群中也存在c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性［5-7］，但是關于其在中國正常人群中的具體發生頻率鮮見報道。針對以上2個方面，我們作了如下研究。

1　對象與方法

1.1研究對象

2014年6月至12月從廣東省梅縣婦幼保健院、平遠縣人民醫院和興寧縣人民醫院、揭陽普寧婦幼保健院以及潮州市中心醫院體檢中心收集的G6PD缺乏全血樣本進行基因檢測，并對其中39例攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性的樣本進行非翻譯區（untranslated regions, UTR) SNP位點檢測。同時，我們收集南方潮州和梅縣、北方鄭州和石家莊（樣本由上海凱普生物有限公司提供）G6PD正常人群全血樣本進行G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性檢測。

1.2方法

1.2.1G6PD活性測定

參照《全國臨床檢驗操作規程》介紹方法［8］，應用全自動生化儀速率法進行G6PD活性缺乏的篩查，酶活性低于5.3 U/L的樣本診斷為G6PD缺乏。

1.2.2DNA提取

采用深圳亞能生物科技有限公司生產的DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.3c.1311C〉T以及IVS?11 93T〉C分型檢測

膜反向斑點雜交法采用深圳亞能生物技術有限公司試劑盒，設計10對引物用于2號～13號外顯子（包括外顯子和外顯子?內含子接合區）的擴增及基因測序。其中11號～12號外顯子引物序列為：上游引物5′?GCAGTGGCATCAGCAAGA；下游引物3′?AGTGACGGGTGGAGGAGA。PCR反應條件：預變性95℃3 min；擴增94℃30 s，55℃30 s，72℃35 s，共35個循環。

1.2.45′?UTR和3′?UTR區域的擴增和測序

針對G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變樣本，設計4對引物用于5′?UTR和3′?UTR區域的擴增和測序，分別是3′?UTR1引物：1F （GCAGACGAGCTGATGAAGA）和1R（GGAGT?GGGACAAGGAA GTG）（738 bp）；3′?UTR2引物：2F（TCACTCCAGCCCAACAGA）2R（GGTC CT?CAGGGAAGCAAA）（397 bp）；5′?UTR1引物：1F （AGGCGGGGAAACCGGACAGT）和1R（GTC CCCTTCGCTCTCGGGGT）（574 bp）；5′?UTR2引物：2F（ACCCCGAGAGCGAAG GGG AC）和2R （CGGCTGGGCATTGGGGAGTG）（330 bp）。

1.2.5測序結果分析

將測序序列用BLAST進行比對，同時對測序圖譜應用Chromas軟件直接分析，從而鑒定基因突變類型。DNA序列比對數據庫：NCBI BLAST （httP：//www.nebi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.2.6統計學分析

G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性在中國南方與北方正常人群之間的比較采用SPSS 16.0專業版軟件做χ2檢驗分析，以P〈0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C的UTR區檢測

我們對粵東地區人群進行G6PD缺乏癥的流行病學調查研究［9］，此次選取了廣東省潮州、揭陽普寧、梅縣、平遠、興寧所檢測出的39例攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C基因多態性的G6PD缺乏樣本，針對3′?UTR和5′?UTR的SNP位點設計引物并進行PCR擴增、測序，這些樣本并未檢測到SNP位點的變異，c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C和3′?UTR測序圖見圖1。

2.2 G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性

我們分別對南方（潮州和梅州）和北方（鄭州和石家莊）G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態性進行調查，在潮州100名健康人群中檢出15例（男6例，女9例），發生率為15%；在梅州100名健康人群中檢出12例（男5例，女7例），發生率為12%。在鄭州50名健康人群中僅發現1例，為男性，發生率是2%；而在石家莊50名健康人群中發現4例，均為女性，發生率是8%。經SPSS16.0專業版軟件χ2檢驗分析，南方正常人群c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C發生率和北方正常人群相比較有統計學意義（P＝0.025）。人類基因計劃組中有G6PDc.1311C〉T在不同國家正常人群中的分布頻率（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），其中歐洲、美國、非洲國家的分布頻率分別為7.16%、12.39%和21.71%，但沒有c.1311C〉T合并IVS?11 93T〉C基因多態性的數據。中國部分地區正常人群中G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C的發生率見表1。

表1　中國部分地區正常人群G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C的發生率Table 1 The frequency of G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C among healthy people in some parts of China

3　討論

目前，世界范圍內已報道190多種G6PD基因突變類型，中國人群中報道發現30多種［5］，幾乎所有的突變都位于G6PD基因的編碼區，且絕大部分為單個堿基置換的錯義突變，但是仍有一些病例無法從經典的分子病理學知識中得到解答。

1989年，有研究者［10］發現G6PD c.1311C〉T突變是一個同義突變，不會造成G6PD氨基酸的替換，常與其它突變共存，在歐洲人中G6PD地中海型c.563 C〉T突變伴發c.1311C〉T，日本人中G6PD c.1264G〉A伴發c.1311C〉T。于國龍等［10］對廣東省G6PD缺乏癥的研究中發現，廣東的G6PD缺乏癥患者c.1311C〉T突變常伴發IVS?11 93T〉C突變，推測由于c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C 2個位點相距較近，可能導致核內不均一RNA（heteroge?neous nuclear RNA，hnRNA）在形成成熟的mRNA過程中，核內的小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）與11內含子的結合引起構象改變致使剪切位點改變，從而引起G6PD酶活性降低。我們在臨床研究中發現，粵東地區的G6PD缺乏病例中c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C這2種靜止突變也常同時出現，而這種病例并沒有發現其它外顯子的突變。

國外有研究者對馬來西亞原住民人群Negrito 的G6PD缺乏者的分子機制進行研究，在這些病例中發現了G6PD基因3′?UTR 3個位點的單核苷酸多態性（SNPs），包括rs112950723、rs111485003和rs1050757，單倍型c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C與rs1050757G強相關，推論rs1050757通過影響mRNA的穩定性和轉錄或者miRNA的調節過程，導致G6PD mRNA降解發生變化，從而致使G6PD缺乏［4］。我們推測中國人群中攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏者也可能連鎖有SNP位點的變異，因此，我們將在廣東、廣西收集的39例攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏標本作為研究對象，針對3′?UTR和5′?UTR 的SNP位點設計引物并進行PCR擴增、測序。通過檢測，39例攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因的G6PD缺乏者沒有檢測到UTR SNP位點的變異。c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因3′端rs1050757位點A到G轉變在馬來西亞原住民人群Negrito中導致酶缺乏有可能局限于本地，與Negrito系東南亞古老居民，長期相對封閉的原始生活環境有關。

c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C基因突變在G6PD正常和缺乏的樣本中均存在，在中國人群G6PD缺乏癥患者中c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的發生率約為5.1%～11.1%，在G6PD正常人群的發生率約為9.4%～18.4%［6］。王穎等［7］對海南黎族人群的研究中發現，在海南黎族男性G6PD缺乏和正常組中c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變發生頻率分別為6.0%和24%。何永蜀等［5］研究顯示云南彝族G6PD缺乏癥患者和健康對照組c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變頻率分別為18.3%和29.9%。我們此次在潮州和梅州G6PD正常人群中檢測出的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的發生率分別為15%和12%，與以往文獻的研究基本一致，由此可見c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變在粵東地區正常人群中普遍存在。多年來，我國學者對于G6PD缺乏癥的研究大多來自南方各省，北方正常人群中是否也存在c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變沒有文獻報道。我們收集了石家莊、鄭州各50名健康人群樣本進行檢測，發現4例c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因，由此可見該突變點在北方正常人群中也存在，只是發生率明顯降低。

c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C為一古老突變，它可能在長期的群體傳遞過程中與其它G6PD突變基因發生交叉，我們認為不完全排除該突變點多態性變異與酶缺陷有關的可能，粵東地區c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變的G6PD缺乏樣本是否還受其他影響酶活性表達的基因調控？我們將對此進一步研究和分析。

參考文獻

［1］Sukumar S，Mukherjee MB，Colah RB. Two distinct Indian G6PD variants G6PD mnagar and G6PD Rohini caused by the same 949 G??〉A mutation［J］. Blood Cells Mol Dis，2005，35（2）：193-195.

［2］Frank JE. Diagnosis and management of G6PD deficien?cy［J］. Am Fam Physician，2005，72（7）：1277-1282.

［3］Mason PJ，Bautista JM，Gilsanz F. G6PD deficiency：the genotype?phenotype association［J］. Blood Rev，2007，21（5）：267-283.

［4］Amini F，Ismail E. 3′?UTR variations and G6PD defi?ciency［J］. J Hum Genet，2013，58（4）：189-194.

［5］何永蜀，李清，楊芳，等.云南彝族人群G6PD基因C1311T突變及單體型研究［J］.中國現代醫學雜志，2015，25（18）：16-20.

［6］蔡稔，朱東林，梁昕，等.廣西地區G6PD缺乏基因型與表型關系的研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2008，16（12）：17-19.

［7］王穎，杜杰，蔡望偉.海南黎族人群葡萄糖?6?磷酸脫氫酶C1311T多態性分析［J］.中國熱帶醫學，2011，11（6）：722-724.

［8］葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.第3版.南京：東南大學出版社，2006：175-178.

［9］Yang H，Wang Q，Zheng L. Incidence and molecular characterization of Glucose?6?Phosphate Dehydroge?nase deficiency among neonates for newborn screening in Chaozhou，China［J］. Int J Lab Hematol，2015，37 （3）：410-419.

［10］于國龍，蔣瑋瑩，杜傳書，等.葡萄糖?6?磷酸脫氫酶cDNA 1311 C T復合11內含子93T C突變［J］.中華血液學雜志，2004，25：610-612.

論著

The investigation of polymorphism on G6PD c.1311C＞T/IVS?1193T＞C and 3′?UTR（untranslated re?gions）

LIN Fen，YANG Hui，WU Jiaoren，YANG Liye
（Central Laboratory，Affiliated Chaozhou Central Hospital，southem Medical University，Chaozhou，Guang?dong，China，521021）

［ABSTRACT］Objective To explore the linkage relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS?11 93T〉Cpoly?morphism with the 3′?UTR polymorphism in the Chinese population, and investigate the frequency of c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C polymorphism in healthy individuals in the eastern Guangdong province and northern China. Methods The activity of G6PD enzyme was analyzed through Auto?bioanalyzer, and the G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C gene polymorphism was detected by DNA sequencing. Specific primers were designed for ampli?fication of the 5′and 3′?UTR of the G6PD gene. Results 39 cases of G6PD deficiency were detected with c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism in the northern China. However, no variation in the 3′and 5′?UTR re?gions was found among those samples. At the same time, c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism was also de?tected in individuals with normal G6PD activity. The frequencies of c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism in healthy individuals of Chaozhou and Meizhou area were 15.7% and 12%, respectively. Furthermore, the frequen?cy of the polymorphism in healthy individuals of Zhengzhou and Shijiazhuang were 2% and 8% respectively. The frequencies of the polymorphism in healthy individuals were statistically significant in the North and thebook=2,ebook=13South. Conclusion The UTR SNP variations were not found among G6PD deficiency samples detected with c.1311C〉T/IVS?1193T〉C gene polymorphism in the eastern Guangdong province. The relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism with G6PD deficiency requires further study.

［KEY WORDS］G6PD deficiency；Gene mutation；Untranslated regions

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金（A2014902,B2013444）；廣東省臨床重點專科建設項目（檢驗科）（2012）；潮州市科技計劃項目（2014S08）

通訊作者：楊立業，E?mail: yangleeyee@sina.com