骨髓間充質干細胞對大鼠肺纖維化的抑制作用

陽成成，吳曉梅

骨髓間充質干細胞對大鼠肺纖維化的抑制作用

陽成成，吳曉梅

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院(哈爾濱 150086)，E-mail：344643928@qq.com

摘要：目的分析大鼠氣管內注入博來霉素(BLMS)后，觀察不同時間點移入骨髓間充質干細胞(MSC)的分化行為，分析細胞因子表達規律及其與病理變化的相關性，確定MSC移植治療實驗性肺纖維化大鼠的最佳時間窗及標準，旨在為臨床上干細胞移植治療肺纖維化的時機提供可靠參考依據。方法體外分離和培養雄性Wistar大鼠的MSC。將60只雌性Wistar 大鼠隨機分為4組：A組為生理鹽水對照組，氣管內注入PBS50 μL；B組為博來霉素模型組，向氣管內注入BLMS 5 mg/kg；C組氣管內注入BLMS后立即尾靜脈注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；D組氣管內注入BLMS 14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。于實驗7 d、14 d、28 d(D組于28 d)分別處死大鼠5只，取肺組織病理切片行HE及Masson染色，觀察肺部炎癥和纖維化情況及羥脯氨酸(HYP)含量測定；提取肺組織通過聚合酶鏈反應( PCR ) 檢測雄性鼠的性別決定基因(SRY)；提取肺組織免疫組織化學法檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白表達。結果病理切片觀察：B組第7天肺泡炎最明顯，28 d時肺纖維化最嚴重，與其他3組比較有統計學意義(P<0．05或P<0．01)；C組、D組肺泡炎及肺纖維化程度均較B組顯著減輕(P<0．05)，但仍較A組嚴重(P<0．05或P<0．01)，其中D組較C組嚴重(P<0．05)。Y染色體性別決定區SRY基因的檢測：A組及B組檢測不到SRY基因，但C組和D組各時間點均能檢測到SRY基因。 HYP含量：B組第7天HYP含量開始升高，28 d達到最高峰，高于其他3組(P<0．05或P<0.01)，與A組相比各時間點HYP含量的差異均具有統計學意義(P<0.01)；C組與D組大鼠HYP含量均呈低水平升高趨勢，造模后7 d、14 d、28 d HYP含量均顯著低于B組(P<0.05)。TGF-β1：B組TGF-β1在14 d時表達最高，28 d時逐漸下降，各組之間比較均有統計學意義(P<0．05)。結論氣管內注入博來霉素可成功復制大鼠肺纖維化模型；MSC可減輕肺泡炎、肺纖維化的程度；MSC到達損傷肺后可能抑制TGF-β1的表達，從而抑制博來霉素誘導肺纖維化的形成。

關鍵詞：特發性肺纖維化；骨髓間充質干細胞；博來霉素；轉化生長因子β1；抑制作用；大鼠

特發性肺纖維化(IPF)是特發性間質性肺炎(IIP)中病理表現為普通型間質性肺炎(UIP)的一種類型，是一種進展的、慢性纖維性肺間質性疾病，主要發生在老年人和肺功能受限的人群中[1]。IPF的特點是進行性呼吸困難和干咳，周邊或基底部網格狀和蜂窩狀為主的影像學表現和病理組織學結果為UIP模式。IPF目前的發病率為(6～14.6)/10萬，在我國尚無確切流行病學資料，但其年發病率呈上升趨勢，男性的發病率和患病率高于女性(1.5∶1～1.7∶1)，且隨著年齡的增加更加顯著[2]。雖然目前IPF的病因仍然不明確，它的發病機制有可能與病毒、真菌、環境因素和有毒因子等有關系，病死率高，5年的生存率與惡性腫瘤相似。因此，IPF嚴重威脅著病人的健康與生命，給病人家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。在IPF治療方法上，尚缺乏有效的治療方法，因此，切實有效的治療IPF的方法已成為目前研究重點和難點。本實驗通過博來霉素(BLMS)制造大鼠肺纖維化模型，用體外培養和分離的骨髓間充質干細胞(MSC)在不同時間點移植入模型組中，觀察對肺纖維化的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料①動物購買，雄性Wistar大鼠60只，體重250 g左右，購于哈爾濱醫科大學附屬二院動物實驗中心。②主要實驗藥物和試劑，博來霉素(Bleomycin，BLM)系日本化藥株式會社產品；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰酶(德國Sigma公司)；DMEM/F12(美國Gibco公司)；轉化生長因子-β1(TGF-β1)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。③主要實驗儀器，電子天平BL610、石蠟切片機、倒置相差顯微鏡、數顯電熱恒溫水溫箱HH.W21.600S、KR-180FA高速離心機、Olympus數碼相機、流式細胞儀、恒溫培養箱、紫外分光光度儀、動物手術器械、紗布、注射器等。

1.2方法①骨髓間充質干細胞的分離培養，將4周齡Wistar雄性鼠一只放至動物實驗室操作臺上，用0.5 mL水合氯醛腹腔注射，用無菌手術刀將鼠股骨和脛骨的皮毛剝離，在股骨頭處剪斷，放入培養皿中；迅速回到細胞間，取出股骨后向脛骨頭剔除肌肉到關節處反向瓣，取出脛骨，放入另一培養皿中；左手用小鑷子夾住骨干，右手用小剪刀將干骺端剪斷，盡量多的保留干骺端；用5 mL 注射器沖洗骨髓直至骨髓變白；以1 000 r/min離心5 min；用吸管吸約5 mL含10%FBS的DMEM/F12到離心管中；血細胞計數器計算細胞總數；按1×106個細胞/cm2接種到T25的塑料培養瓶；將培養瓶放入37.0 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養；72 h后去除未貼壁的造血細胞、全量換液，以后每隔(2～3) d換液1次。10 d～14 d，待貼壁細胞85%融合后需進行消化傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化；待大部分細胞變圓懸浮后，加入10 mL含10%FBS的DMEM/F12培養液終止消化；用含10%FBS的DMEM/Fl2培養液重新懸浮細胞；按1∶2傳代培養。以后各傳代過程如上，根據細胞密度調整細胞傳代時間及比例。

1.3動物分組大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL /100 g)麻醉，銳性分離淺筋膜，用 1 mL注射器在兩個環狀軟骨之間刺入。氣管內注入含博來霉素的生理鹽水(0.2～ 0.3) mL(5 mg /kg)，對照組氣管內注入等體積生理鹽水，以大鼠長軸為中心，立即旋轉大鼠，使藥液在肺內分布均勻，縫合頸部皮膚，局部青霉素消毒防止感染。將(220～250) g雌性Wistar大鼠60只隨機分入以下各組，各組15只。生理鹽水對照組(A組)即刻氣管內注入PBS溶液50 μL；BLMS模型組(B組)，即刻氣管內注入博萊霉素5 mg/kg；MSC治療組(C組)，即刻氣管內注入博萊霉素后立即尾靜脈注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；MSC治療組(D組)，氣管內注入BLMS14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。

1.4標本采集與處理4組分別于造模后7 d、14 d、28 d各隨機處死5只。稱取小鼠體重，剖開腹腔，充分暴露腹主動脈，經腹主動脈放血后處死；剪開胸腔，分離肺組織，從右主支氣管氣管插管，然后結扎近端，注入4%多聚甲醛，完全冷卻后加入固定液使肺復張，置于同樣固定液中浸泡右肺，石蠟包埋和連續性切片，切片厚度為4 μm，其中一部分進行HE染色和Masson染色做組織診斷學用，另外一部分進行免疫組化染色。

1.5動物一般情況觀察Wistar大鼠精神狀態、反應靈敏度、活動情況、被毛(被毛是否光滑、有無光澤、有無脫毛)、皮膚(顏色、溫度、彈性等)、食欲、體重、死亡情況。

1.6病理組織學改變HE染色參照Szapiel等方法，觀察肺泡炎的程度。0級：無肺泡炎；Ⅰ級：輕度肺泡炎，鏡下可見到肺泡間隔是由于單核細胞浸潤而增厚，但病變僅僅局限于局部和胸膜底部，所占面積少于全肺20%，肺泡結構正常；Ⅱ級：中度肺泡炎，肺泡炎癥病變較廣泛，受累面積占全肺的20%～50%，胸膜基底部較重；Ⅲ級：彌漫性肺泡炎，病變范圍>50%，偶可見到肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。

1.7膠原纖維染色的定性分析參照Fulmer方法，用Masson染色將肺纖維化分5級：0級：正常肺組織；Ⅰ級：微小纖維化，肺泡間隔基本正常，局部有間質纖維化，無肺泡的破壞及肺網架結構的改變，肺膠原纖維與正常肺相比升高不小于10%；Ⅱ級：輕度纖維化，肺泡間隔為輕度增厚，部分區域有正常肺泡，全肺的膠原纖維與正常肺相比占10%～25%；Ⅲ級：中度纖維化，肺泡間隔中度增厚，正常肺泡少見，間質結構破壞，全肺膠原纖維與正常肺相比升高至25%～40%；Ⅳ級：嚴重纖維化，所有的肺泡間隔均有不同程度增厚，但仍有可辨認的肺泡結構存在，許多修復部位失去正常間質結構，全肺膠原纖維與正常肺相比升高至40%以上。

1.8大鼠肺組織細胞來源檢測取(50～100) mg肺組織按照組織基因組DNA提取試劑盒方法，分別于C組7 d、14 d、28 d及D組28 d肺組織提取DNA，聚合酶鏈反應(PCR)擴增SRY基因。以2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統攝像，以雌、雄Wistar大鼠為陰、陽性對照。合成SRY大鼠基因，上游引物：5’- tttagtgttcagccctacagcc-3’，下 游 引 物：5’-atgctgggattctgttgagcc-3’，擴 增 長 度為322bp； 內參照：β 肌動蛋白(β-actin ) 上游引物：5’-cacgatggaggggccggactcatc-3’，下游引物：5’-taaagacctctatgccaacacagt-3’，擴增長度為240 bp。聚合酶鏈反應(PCR)擴增反應條件：94 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，52 ℃退 火30 s ，72 ℃退火3 0s，循環50次，72℃延伸7 min。

1.9HYP檢測取各組大鼠右肺中上葉稱重(50 mg)，采用分光光度計560 nm波長比色，記錄吸光度值，根據試劑盒所給公式計算待測標本的HYP含量，確定肺組織纖維化程度。

1.10免疫組織化學法測定TGF-β1蛋白表達免疫組化檢測指標的半定量分析，自動計算其積分光密度(integrated optical density，IOD)值進行半定量分析。

1.11統計學處理采用SPSS13．0統計軟件處理，P<0.05為有統計學意義，統計方法使用方差分析等。

2結果

2.1細胞培養第1天即貼壁，第2天時貼壁細胞較多，第3天可以看到骨髓細胞在培養瓶中長出明顯的MSC克隆，為橢圓形、梭狀，似成纖維細胞樣。骨髓內的造血干細胞等其他的細胞在培養瓶中為懸浮方式生長，經多次換液后造血干細胞及其他的細胞逐漸減少。約10 d后原代細胞85%融合，進行傳代。傳代后細胞度過抑制期后迅速增長，每傳1代需要(3～4)d，隨著傳代次數的增加，細胞形態呈均勻一致的長梭形，排列成旋渦狀或放射狀 。

2.2大鼠術后觀察A組大鼠術后蘇醒很快，蘇醒后僅有短暫活力下降，恢復術前的活力快，進食好，體重逐漸增長；B組大鼠術后蘇醒較慢，不愛活動，進食較少，皮毛凌亂、無光澤，唇及爪發紺，可以聽到大鼠的喘息聲，體重明顯減輕；C組大鼠術后蘇醒較慢，術后4 d～5 d內活力較差，進食較少，體重不增長，第5天后大鼠一般情況逐漸好轉，體重逐漸增長。D組大鼠術后蘇醒更慢，于術后7 d、8 d活力仍差，進食少，體重不增長，第8天后小鼠一般情況才逐漸好轉，體重逐漸增長。

2.3肺組織HE染色、Masson染色A組光鏡下可見肺泡間隔無增厚，無水腫、炎癥及纖維化表現，肺泡腔沒有縮小，且無明顯滲出。B組灌注博來霉素后的7 d內表現為急性炎癥，肺泡的間隔增厚，肺泡腔及間隔內炎癥細胞聚集；第14天炎性細胞滲出明顯減輕，肺泡間隔增厚，而成纖維細胞增多，肺組織以纖維化改變為主。第28天肺泡結構破壞，肺泡腔明顯縮小，肺間質被膠原纖維和成纖維細胞替代，纖維化明顯。C組：于7 d肺組織的充血明顯減輕，點狀出血明顯減少，14 d和28 d雙肺顏色發暗，表面較粗糙，體積縮小不明顯。各時間點肺泡炎與肺纖維化評分與B組比較均顯著減輕(P<0．05)，仍較A組嚴重(P<0．05)。D組：28 d時雙肺顏色暗，表面粗糙，體積縮小不明顯。肺泡炎較B組減輕，肺纖維化評分較B組減少，但均較A組、C組嚴重。各組肺泡炎及肺纖維化評分結果見表1、表2。

表1　各組肺泡炎程度比較(±s)　分

表2　各組纖維化程度比較(±s)　分

2.4Y染色體性別決定區SRY基因檢測A組及B組檢測不到SRY基因，但C組和D組各時間點均能檢測到SRY基因。

2.5HYP檢測肺組織纖維化程度B組注BLM后7 d，HYP含量開始升高，28 d達到最高峰，高于其他3組，與A組相比各時間點HYP含量有統計學意義(P<0.01)。C組與D組大鼠HYP含量均呈低水平升高趨勢，造模后7 d、14 d、28 dHYP含量均顯著低于B組(P<0.05)。與形態學肺纖維化觀察結果相一致(見表3)。

表3　大鼠肺組織HYP含量比較(±s)　μg/g

2.6大鼠肺組織中TGF-β1大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達在胞漿呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于肺泡巨噬細胞胞漿中，以細胞胞漿、胞膜、細胞外基質染為棕色為陽性；每張切片選取5個視野，計陽性細胞數/高倍視野(見表4)。博萊霉素處理大鼠的肺組織TGF-β1表達明顯、范圍廣，特別是在第14天時肺泡腔和間質中出現大量的TGF-β1強陽性的肺泡巨噬細胞，肺組織中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞，可以單個或成群肺泡巨噬細胞出現。

表4　各組TGF-β1表達陽性巨噬細胞數

3討論

在間質性肺疾病中，以IPF最為常見，預后極差，從最初確診到死亡的平均時間是(3～5)年。盡管過去數十年在IPF發病機制研究取得了很大進展，但其發病機制尚不十分清楚。過去認為IPF是一種慢性的炎癥反應，因而解釋了最初使用皮質類固醇激素治療的原因。目前糖皮質激素為治療IPF的經典藥物，但是僅有10%～30%的IPF病人對糖皮質激素治療有一定的療效[3]，而且沒有完全或持續緩解者，因此有學者不推薦單獨使用糖皮質激素治療IPF病人。且糖皮質激素副反應大，臨床應用受限。近年來，隨著對本病發病機制和病理生理變化的研究以及分子生物學技術的應用，干細胞的研究引起了人們的極大關注，其中研究最多的是MSC。在體外特定的條件下，MSC 可以定向誘導分化為骨、軟骨、脂肪、心肌、神經、皮膚上皮、肝臟、胰島B 細胞等多種類型細胞[4]，被認為是組織工程領域的理想種子細胞來源。本實驗研究的是MCS對博來霉素誘導的肺纖維化的治療機制。文獻上報道的構建肺纖維化模型的方法有多種，如應用博來霉素、百草枯、放射線、高濃度氧等，博萊霉素氣管內給藥因存在方法可靠、操作簡單、制模時間短等[5]優點，且博萊霉素致纖維化動物模型與人類IPF的病理學改變相似，所以用博萊霉素復制肺纖維化動物模型是目前普遍采用的方法[6]。本實驗表明：灌注博來霉素后7 d內表現為急性炎癥，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔及間隔內炎癥細胞聚集；于第14天時炎性細胞滲出減輕，成纖維細胞增多，肺組織以纖維化改變為主。于第28天肺泡結構破壞，肺泡腔明顯縮小，纖維化明顯。說明大鼠肺纖維化模型造模成功。

骨髓來源干細胞療法是生物學發展最為迅速的領域之一。骨髓間充質干細胞是由中胚層發育的早期細胞，有著較強的自我增殖能力和多向分化潛能，因此為許多復雜疾病的治療帶來了曙光。按發生學來源可將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。近年來，越來越多的證據表明成體干細胞具有較強的多系分化潛能，大量的研究顯示成體干細胞可以向包括肺組織在內的多種非造血細胞類型分化[7]。作為成體干細胞的一種，MSC在研究和應用方面具有以下優點：①可自體移植避免了免疫排斥；②在正常情況下處于靜止狀態，只有在病理情況下才顯示出一定的自我更新潛能，因此癌變的可能性較小；③由于分化潛能比較局限，更容易被誘導向特定的組織細胞分裂，可以直接用于體內組織的原位修復；④某種類型的成體干細胞有向同種組織的損傷部位遷移的趨勢，這有助于臨床應用干細胞來進行疾病替代治療時的定位；⑤分離和使用成體干細胞不存在倫理學問題[8]。至今為止，MSC的分離、培養方法比較常用的是貼壁細胞分離法、密度梯度離心法、流式細胞分選法、免疫磁珠分離法等。本實驗所采取的是全骨髓貼壁細胞分離法，這個方法操作比較簡單、快速、容易掌握、不易污染，比較符合細胞生長的微環境，可經過多次傳代以獲得足夠量細胞的優點。收集第4代MSC細胞用于實驗，經過3次傳代后可以獲得足夠的細胞數量；另外第4代細胞很好地保持了其分化特性，符合實驗要求。

轉化生長因子-β1最初是從血小板中分離出來的一種細胞因子，因其能促進成纖維細胞轉化生長而得名。它是由多種細胞分泌的具有多重生物學效應的細胞因子。TGF-β1是迄今發現的最強的細胞外基質沉積促進劑，其作用于多個環節，刺激各種細胞外基質成分合成和沉積，在減少基質降解酶及增加降解抑制劑合成的同時，還是一個強大的細胞增殖調節劑，促進肺成纖維細胞增殖，在肺纖維化發展中起關鍵作用，是目前研究最多的纖維化促發因子[9]。早期通過趨化炎癥細胞參與肺損傷和炎癥反應，而后主要是促進細胞外基質形成和抑制其酶解作用，促進纖維蛋白原向肌成纖維細胞轉化，同時影響其他纖維化細胞因子，導致纖維化發生[10]。本實驗研究結果表明，博來霉素灌注后第7天可見肺泡腔和間質中出現較多的TGF-β1強陽性的肺泡巨噬細胞，第14天時肺泡腔和間質TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞達到高峰，于第28天肺組織中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞比第7天及第14天減少。與B組比較，C組、D兩組肺組織中TGF-β1陽性的巨噬細胞數量明顯少，差異有統計學意義。

外源性MSC的確能移植到損傷肺組織中，并具有減輕肺泡炎、肺纖維化的作用。MSC在體外培養即能分泌TGF-β1，且該細胞因子有抑制淋巴細胞增殖的作用，而當MSC進入實驗動物體內后，由于微環境的改變，TGF-β1的表達可能會有改變，因此其在這個修復過程中的作用需進一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

中圖分類號：R551.3R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.011

文章編號：1672-1349(2016)10-1091-04

(收稿日期：2016-03-03)