博來霉素對轉基因橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum）生長及油脂積累的影響

陳 娟，丁蘭平，李 奧，李園園，劉麗麗

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

小球藻是一類真核單細胞藻類，屬于小球藻目（Chlorellales）小球藻科（Chlorellaceae）. 國內外廣泛培養的橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）現分別被命名為橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum） 和 蛋 白 核 異 養 球 藻（Auxenochlorella pyrenoidosa），與小球藻屬（Chlorella）一起統稱為小球藻類（Chlorella complex）[1]. 小球藻類富含蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質和碳水化合物，也是已知含量最高的葉綠素來源，其葉綠素質量分數超過2%[2-3].由于營養價值高且有利于健康，小球藻類已成為人們重要的營養補充劑，也可以加工成動物飼料和其他高價值產品[3-4]. 小球藻的脂質含量高，超過大多數陸生植物，是生物燃料生產的最佳候選微藻物種，也是最具潛力、最能實現可持續供給油脂的生物質資源之一[5-8].另外，作為理想的研究基因表達及生理生化性質的藻種，小球藻類也已廣泛應用于基因工程領域[9]. 利用生物反應器培養轉基因小球藻類具有比較明顯的優勢，其分離純化表達產物和操作方法步驟簡單，產業化培養技術成熟，適宜于規模化生產[10-11].

我國抗生素的產量和使用量逐年增加，且存在過度使用的情況.抗生素的濫用，對陸地和水體環境均構成了潛在污染[12-13].博來霉素是一種水溶性抗生素，應用廣泛.有研究發現，博來霉素能抑制微擬球藻的生長[14-15].Gus 基因是目前應用較多的一種報告基因，可編碼β-葡萄糖苷酸酶，用于檢測外源基因的轉化效率，方法簡單且靈敏度高[16].基于人工導入外源目的基因的小球藻類可能在環境適應、生長和油脂轉化等方面發生變化的設想，本課題組前期利用基因轉染技術將Gus 基因成功轉入野生型橢圓球藻[17]，期望篩選到適應環境能力強、生長快且產油率高的轉基因培養品系.在此基礎上，本研究擬通過對比分析不同濃度的博來霉素對轉基因橢圓球藻pUGus 和野生型橢圓球藻的細胞密度、藻粉和油脂產量的影響，進一步了解外源基因片段對小球藻類敏感性、生長速率和代謝物生成的影響，為篩選環境適應能力強、產油率高的優質轉基因橢圓球藻新品系以及構建生物能源生產模式提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

野生型橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum（SD-0701），購于中國科學院淡水藻種庫；pUGus 型橢圓球藻（SD-0702，將Gus 基因轉入野生型橢圓球藻），由天津師范大學微生物實驗室保存.

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、Ca（NO3）2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O，分析純級（AR），購自天津市科密歐化學試劑有限公司；博來霉素，分析純級（AR），購自天津智藍欣佰生物技術有限責任公司.

Knap 培養基（/L）：葡萄糖3 g、酵母粉3 g、Ca（NO3）20.1 g、KH2PO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、KCl 0.012 g、FeCl3·6H2O 0.2 g.共設置9個處理組，博來霉素質量濃度梯度為：0（對照組Ⅰ和對照組Ⅱ）、4、6、8、10、12、14 和16 μg/mL，每組各3個重復，共27個處理.

1.2 方法

取對照組Ⅰ處于對數生長期的2 種橢圓球藻細胞各3.676×107個，分別轉接至對照組Ⅱ和7個博來霉素含量不同的處理組中，培養基體積為30 mL，保證每瓶接種量一致，光照強度50 μmol/（m2·s）、25 ℃條件下靜置培養8 d，每組各3個重復，共24個處理.

1.2.1 標準曲線繪制

藻液細胞密度與吸光度標準曲線繪制：取對照組Ⅰ中處于指數期或者穩定期的密度較大且無污染的藻種原液，分別稀釋2、4、6、10、20、40、60 和100 倍，利用分光光度法和血球計數法測定不同稀釋倍數藻液的OD680值和細胞密度，以細胞密度為橫坐標，OD680值為縱坐標，得到藻液吸光度與細胞密度的標準曲線：y0=25.879x-1.776，R2=0.9756，其中x為細胞密度（106mL-1），y0為藻液的OD680值.

油脂含量與吸光度標準曲線繪制：分別稱取對照組Ⅰ的干制藻粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，以香草醛比色法浸提待測樣品的總脂[18]，在528 nm 下進行比色.繪制標準曲線：y1=5.8246x+0.0957，R2=0.9970，其中x為油脂質量，y1為OD528值.

1.2.2 干藻粉的制備

橢圓球藻培養至第8 天，取各處理組的藻液10 mL，3500 r/min 下離心4 min，去除上清，收獲沉淀.將沉淀在-80 ℃冰箱中反復凍融2 次，每次間隔12 h，于25 ℃下風干約48 h 至恒重.

1.2.3 細胞密度、藻粉產量及油脂含量的測量

每天定時取樣，利用紫外分光光度計測量各個處理組藻液的OD680值，根據標準曲線y0計算藻液細胞密度.稱量1.2.2 制備的藻粉干重并計算產量.取各處理組干藻粉2 mg，以香草醛比色法制備待測樣品的總脂，測定樣品的OD528值，根據標準曲線y1計算橢圓球藻的產油率及油脂產量.

1.3 數據處理

用Excel 進行數據處理，用Spss17.0 軟件進行單因素方差（One-Way ANOVA）統計分析.

2 結果與分析

2.1 博來霉素對橢圓球藻生長的影響

培養基中添加不同質量的博來霉素，培養期內SD-0701 和SD-0702 的生長情況如圖1 所示.

圖1 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 細胞密度的影響Fig.1 Effect of zeocin on the cell density of SD-0701 and SD-0702

由圖1 可以看出，隨著培養時間的延長，SD-0701和SD-0702 的生長均呈上升趨勢.博來霉素對2個藻株的生長均存在一定的抑制作用，且質量濃度越大抑制作用越明顯.比較2個藻株的生長情況可知，博來霉素對野生型橢圓球藻（SD-0701）的抑制作用顯著強于pUGus 型橢圓球藻（SD-0702）.

博來霉素雖然對SD-0701 生長的抑制作用明顯，但受濃度影響較小，在培養的第8 天，對照組中SD-0701 的細胞密度達7.494×108mL-1，各博來霉素濃度處理組中的細胞密度相近，約為0.756×108mL-1.博來霉素對SD-0702 生長的抑制作用明顯受濃度的影響，濃度越高抑制越強烈.不添加博來霉素的2個對照組中，SD-0701 和SD-0702 的生長狀況存在差異，在培養的第8 天，SD-0702 的細胞密度為6.377×108mL-1，低于SD-0701 的細胞密度.SD-0701 在培養基中添加博來霉素后基本處于停止生長的狀態，博來霉素質量濃度為4 μg/mL 時抑制率已經達到87.31%；而SD-0702僅在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來霉素后基本處于停止生長的狀態，抑制率分別為88.68%和88.63%，添加4 μg/mL 時抑制率僅為12.23%.由此可見，SD-0701對博來霉素的抗性差，而SD-0702 對博來霉素的抗性較強，且與博來霉素的濃度相關，低濃度的博來霉素對SD-0702 生長的影響較小，高濃度的抑制作用明顯.

2.2 博來霉素對橢圓球藻藻粉產量的影響

靜置培養的第8 天，各處理組中橢圓球藻藻粉的產量如圖2 所示.

圖2 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 藻粉產量的影響Fig.2 Effect of zeocin on the yield of algal powder of SD-0701 and SD-0702

由圖2 可以看出，博來霉素對SD-0701 和SD-0702的藻粉產量均存在一定的抑制作用.培養基中未添加博來霉素時，SD-0701 的藻粉產量略高于SD-0702，分別為3.34 g/L 和3.21 g/L. 添加博來霉素后，因SD-0701 對博來霉素敏感，細胞生長受到嚴重抑制，因此制備不出藻粉.博來霉素對SD-0702 藻粉產量的抑制作用明顯受添加量的影響，濃度越高抑制越明顯.博來霉素質量濃度為4 μg/mL 和6 μg/mL 時，SD-0702 的藻粉產量分別降低12.44%和13.81%，隨著博來霉素質量濃度的增加，藻粉產量大幅度下降，質量濃度為14 μg/mL 和16 μg/mL 時，藻粉產量分別下降58.64%和66.31%.

2.3 博來霉素對橢圓球藻含油率和油脂產量的影響

培養基中添加不同質量的博來霉素時，各處理組中SD-0701 和SD-0702 的含油率和油脂產量如圖3所示.

圖3 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 含油率和油脂產量的影響Fig.3 Effect of zeocin on oil content and yield of SD-0701 and SD-0702

由圖3（a）可以看出，不添加博來霉素時，SD-0701的含油率略高于SD-0702，分別為14.20%和13.61%.培養基中添加博來霉素時，SD-0702 的含油率明顯受博來霉素濃度的影響，低濃度會稍微促進其油脂積累，高濃度則產生抑制作用.博來霉素質量濃度為4、6和8 μg/mL 時，SD-0702 的含油率分別為14.38%、14.27%、13.66%，超過對照組的含油率；質量濃度為10、12、14和16 μg/mL 時，SD-0702 的含油率分別為13.10%、12.70%、10.26%和9.89%，低于對照組的含油率.

由圖3（b）可以看出，不添加博來霉素時，SD-0701和SD-0702 油脂產量分別為0.474 g/L 和0.436 g/L.博來霉素質量濃度較低時（≤6 μg/mL），SD-0702 的油脂產量略有下降，博來霉素質量濃度超過6 μg/mL 時，油脂產量急劇下降.

3 討論

本研究以野生型橢圓球藻（SD-0701）和含有外源基因Gus 的橢圓球藻（SD-0702）為實驗材料，在Knap培養基中添加不同質量的博來霉素，觀察測量2個藻株的生長、藻粉產量、含油率和油脂產量.培養基中不添加博來霉素時，野生型橢圓球藻的細胞密度、藻粉產量、含油率和油脂產量均高于含有外源基因Gus 的橢圓球藻.吳海月等[19]研究發現，含有外源基因Gus 的藻株性能較野生型藻株低，生長速率低，代時長，藻粉產量低，油脂產量也低，與本研究結果相符.當添加博來霉素時，轉入外源基因Gus 的藻株生長速率明顯高于野生型藻株.博來霉素質量濃度為4 μg/mL 時，野生型藻株的生長就受到顯著抑制；隨著培養基中博來霉素濃度的增加，轉入外源基因Gus 的藻株所受的抑制作用也隨之增強，但在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來霉素時才受到較強的抑制作用.張琳等[15]研究表明，微擬球藻對博來霉素高度敏感，在固體培養時，0.5 μg/mL博來霉素即可完全抑制微擬球藻生長，在液體培養時，1 μg/mL 博來霉素即可完全抑制其生長.本研究結果表明，在Knap 液體培養基中添加4 μg/mL 博來霉素時野生型橢圓球藻基本停止生長，與微擬球藻的完全抑制濃度不同，這可能是由于不同藻種對博來霉素的敏感程度不同.

培養基中添加4 μg/mL 的博來霉素時，2 種橢圓球藻的生長均開始受到抑制，此時博來霉素對SD-0701的抑制率達到87.31%，對SD-0702 的抑制率僅有12.23%.由于SD-0701 在博來霉素質量濃度為4 μg/mL時已經基本停止生長，藻粉產量微小無法制備，油脂產量極低；但SD-0702 在此質量濃度下藻粉產量和油脂產量的抑制率僅分別為12.44%和8.49%，當質量濃度為16 μg/mL 時藻粉產量和油脂產量的抑制率分別達到66.31%和75.46%. 由此可見，SD-0701 對博來霉素的抗性差，而SD-0702 具有較強抗性，且與博來霉素濃度相關，高濃度的博來霉素對SD-0702 有顯著抑制作用.

綜合以上結果，野生型橢圓球藻內轉入外源基因Gus 確實能夠影響其對抗生素的敏感性、生長速率和代謝物的生成.野生型橢圓球藻對博來霉素很敏感，抗性差；轉入外源基因Gus 的橢圓球藻對博來霉素敏感程度弱，抗性較強.相對于野生型橢圓球藻，轉入外源基因Gus 的藻株在低抗生素污染的水體中具有適應能力強、生長情況好以及產油率高的特性，適合在低污染水體中推廣應用.另外，本研究也表明博來霉素可作為篩選培養基，用于識別小球藻類的抗性基因.