以紅寶石無核葡萄為親本胚挽救育種技術(shù)的研究

郭艷芳，張 娜，田淑芬，月 丫

（1.天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，天津300192；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384）

在葡萄育種工作中，選育品質(zhì)優(yōu)良的無核葡萄新品種是一項(xiàng)重要內(nèi)容[1].在常規(guī)的雜交育種中，選配雜交組合親本時(shí)，無核品種只能作父本同有核品種雜交，在這樣的雜交組合中，后代的無核幾率通常低于15.9%[2]. 1982 年，Ramming等[3]創(chuàng)立了胚挽救技術(shù)，以無核葡萄為母本胚挽救獲得了后代，使得無核葡萄作母本成為可能[3].胚挽救技術(shù)可以提高后代的無核率，縮短育種周期，已被廣泛應(yīng)用于無核葡萄的種質(zhì)創(chuàng)制中[4-5].通常不同葡萄品種以及不同雜交組合間的胚挽救效果存在很大差異[6-8].染色體是基因的主要載體，其數(shù)目和形態(tài)是區(qū)別不同物種的重要標(biāo)志之一.染色體計(jì)數(shù)法是以植物的根尖、莖尖、卷須、葉片、愈傷組織等為材料觀察細(xì)胞染色體數(shù)目，確定植物倍性的最基本和最精確的方法.在葡萄育種研究中，對(duì)染色體進(jìn)行觀察是鑒定后代及親本材料的重要方法.如晁無疾等[9]以葡萄的卷須為材料，用改良的去壁低滲法觀察染色體數(shù)目；郭紫娟[10]以葡萄莖尖為材料，采用去壁低滲法觀察了75個(gè)葡萄品種品系的染色體；常金華等[11]通過觀察卷須和莖尖的染色體數(shù)目，鑒定出玫瑰香葡萄的多倍體變異植株.

紅寶石無核葡萄（Red Ruby Seedless）是晚熟無核品種，果穗大，外形呈長(zhǎng)圓錐形，果肉較脆，味甜低酸，品質(zhì)佳，非常適合鮮食[6].本研究以紅寶石無核葡萄為親本，基于無核葡萄胚挽救影響因子的研究基礎(chǔ)[7-8]，探究不同親本、取樣時(shí)間以及培養(yǎng)基對(duì)紅寶石無核×希姆勞特（Himrod Seedless）、紅寶石無核×玫瑰香（Muscat Hamburg）、紅寶石無核×巨玫瑰（Jumeigui）優(yōu)系葡萄雜交后代胚發(fā)育萌發(fā)的影響，并對(duì)親本及雜交后代進(jìn)行了染色體倍性鑒定以確定雜交是否成功.本研究以期為篩選出優(yōu)良的葡萄胚挽救育種組合，提高無核葡萄幼胚的離體發(fā)育、萌發(fā)和成苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

材料選自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地，2018 年4 月—10 月在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地和天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn).共計(jì)3個(gè)雜交組合，如表1 所示.

表1 胚挽救雜交組合設(shè)計(jì)Tab.1 Cross combinations of embryo rescue

1.2 方法

1.2.1 田間雜交授粉

根據(jù)當(dāng)年母本植株開花情況，待5%左右的小花開放時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯、飽滿的花穗剝離花冠，取出花藥，去除花絲，在自然條件下陰干，收集到裝有變色硅膠的玻璃小瓶里，保存于4 ℃冰箱，授粉時(shí)備用[12-14].花前1～2 d 對(duì)母本進(jìn)行人工去雄，每個(gè)組合去雄15 穗，去雄后即刻套袋，第2 天開始授粉，每天授粉2 次，連授3 d，每次授粉完即刻套袋，并標(biāo)識(shí)雜交組合和授粉時(shí)間.

1.2.2 幼果采集

不同葡萄品種的幼果取樣時(shí)期不同，開始取樣后每7 d 取樣1 次，連取3次.取樣時(shí)期均為花后54、61和68 d.將幼果帶果柄采回后放置在4 ℃冰箱中備用.

1.2.3 胚珠離體培養(yǎng)

對(duì)幼果進(jìn)行計(jì)數(shù)，沖洗消毒后置于無菌培養(yǎng)皿中，用解剖針剝?nèi)∨咧椋謩e接種在N1 培養(yǎng)基（Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3 + 60 g/L蔗糖+5 g/L 瓊脂+1 g/L 活性炭，pH 值為5.8）和E1 培養(yǎng)基（ER+1.5 mg/L IAA +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+60 g/L 蔗糖+5 g/L 瓊脂+1 g/L 活性炭）中，于（25±2）℃培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)瓶中接入15個(gè)胚珠[15].胚珠離體培養(yǎng)60 d 后，計(jì)算胚發(fā)育率（%）=發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)×100.

1.2.4 胚離體培養(yǎng)

胚珠離體培養(yǎng)60 d 后，在超凈工作臺(tái)進(jìn)行剝胚工作.將離體胚分成2 組，分別接種到W1 培養(yǎng)基（WPM+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+5 g/L 瓊脂+1.5 g/L 活性炭，pH 值為5.8）和M1 培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+1 g/L 活性炭+5 g/瓊脂L+1.5 g/L 活性炭）中，于（25±2）℃培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng).剝胚時(shí)，若剝出亮白色的胚，則視為胚發(fā)育；若胚珠內(nèi)無胚或胚褐化，則視為胚敗育[16].胚萌發(fā)培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率，50 d 后統(tǒng)計(jì)成苗率.

1.2.5 染色體倍性鑒定

用根尖染色體計(jì)數(shù)法對(duì)紅寶石無核×巨玫瑰雜交苗及親本進(jìn)行倍性鑒定.取根尖在清水中沖洗，放入0.002 mol/L 的8-羥基喹啉溶液中處理3～4 h.蒸餾水洗凈沖洗3 次，于卡諾固定液中固定24 h.將固定后的根尖用蒸餾水沖洗3 次，浸于70%的酒精后，于4 ℃冰箱保存.取保存的根尖，用蒸餾水沖洗3 次，浸泡于1 mol/L HCl 中，60 ℃水浴鍋中解離8～10 min.蒸餾水沖洗3 次，用改良的石碳酸品紅溶液染色15 min. 留染色后根尖0.2～0.5 cm，滴1 滴石碳酸品紅染液進(jìn)行蓋片、壓片，光學(xué)顯微鏡觀察染色體并計(jì)數(shù).

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用WPS 軟件和SPSS 17.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析（P ＜0.05）.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同父本對(duì)胚挽救結(jié)果的影響

比較各雜交組合授粉后雜交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率，結(jié)果如表2 所示.由表2 可以看出，以玫瑰香和巨玫瑰葡萄為父本的胚發(fā)育率和萌發(fā)率均顯著高于以希姆勞特葡萄為父本的胚挽救發(fā)育率，即有核葡萄為父本比無核葡萄品種為父本的胚發(fā)育率和萌發(fā)率高.

表2 不同父本對(duì)胚挽救結(jié)果的影響Tab.2 Effects of different male parent on embryo rescue

2.2 取樣時(shí)期對(duì)胚生長(zhǎng)發(fā)育的影響

3個(gè)雜交組合在不同取樣時(shí)期胚的生長(zhǎng)發(fā)育情況如表3 所示.由表3 可以看出，各組合的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率均在花后61 d 取樣最佳，顯著高于其他取樣時(shí)期的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率.

表3 不同取樣時(shí)期下幼胚生長(zhǎng)發(fā)育情況Tab.3 Growth and development situation of embrgo in different sampling dates

2.3 不同發(fā)育培養(yǎng)基下幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育情況

分別采用N1 和E1 培養(yǎng)基對(duì)紅寶石無核×玫瑰香和紅寶石無核×希姆勞特雜交胚珠進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，結(jié)果如表4 所示.

表4 不同發(fā)育培養(yǎng)基下幼胚發(fā)育情況Tab.4 Growth and development situation of embrgo in different developed medium

由表4 可以看出，2 組雜交胚在N1 培養(yǎng)基上的發(fā)育率（13.92%、8.00%）均顯著高于在E1 培養(yǎng)基上的發(fā)育率（9.57%、6.54%）.因此從發(fā)育率來看，N1 培養(yǎng)基更適合2個(gè)雜交組合離體胚珠的發(fā)育，且無論是在N1培養(yǎng)基還是E1 培養(yǎng)基上，紅寶石無核×玫瑰香葡萄雜交組合的胚珠發(fā)育率均比紅寶石無核×希姆勞特葡萄雜交組合的胚珠發(fā)育率高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）.

2.4 不同萌發(fā)培養(yǎng)基下幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育情況

分別采用W1 和M1 培養(yǎng)基對(duì)紅寶石無核×希姆勞特和紅寶石無核×玫瑰香的雜交胚進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表5 所示.

表5 不同萌發(fā)培養(yǎng)基下幼胚生長(zhǎng)發(fā)育情況Tab.5 Growth and development situation of embryo in different germination medium

由表5 可以看出，紅寶石無核×希姆勞特的離體胚在W1 培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，胚萌發(fā)率為50.40%，成苗率為14.49%，顯著高于經(jīng)M1 培養(yǎng)基培養(yǎng)之后胚的萌發(fā)率（35.37%）和成苗率（0）.紅寶石無核×玫瑰香的離體胚在M1 培養(yǎng)基上的胚萌發(fā)率（65.59%）顯著高于其在W1培養(yǎng)基上的胚萌發(fā)率（54.94%），但成苗率為4.05%，在W1 培養(yǎng)基上的成苗率為17.09%，表明M1 培養(yǎng)基適合紅寶石無核×玫瑰香雜交胚的萌發(fā)，W1 培養(yǎng)基更利于其成苗.

2.5 染色體倍性鑒定

對(duì)紅寶石無核×巨玫瑰雜交苗及親本進(jìn)行染色體倍性鑒定，共獲得9 株雜種胚挽救幼苗，其中4 株為三倍體（triploid hybrid）幼苗，5 株為二倍體（diploid hybrid）幼苗.不同親本及雜交苗的染色體倍性鑒定結(jié)果如圖1 所示.

圖1 紅寶石無核×巨玫瑰雜交苗及親本的根尖染色體Fig.1 Root tip chromosome of hybrid single plant and parent of Red Ruby Seedless×Jumeigui

3 討論與結(jié)論

無核葡萄胚挽救育種過程中，親本基因型是決定胚發(fā)育萌發(fā)的首要因素.母本基因型對(duì)胚挽救效果的影響程度較大，同時(shí)父本也對(duì)胚挽救效率有一定的影響[17].本研究以紅寶石無核葡萄為母本，分別以希姆勞特?zé)o核、玫瑰香和巨玫瑰為父本，探究不同父本基因型對(duì)無核葡萄胚挽救效果的影響，并對(duì)紅寶石無核×巨玫瑰親本及雜交后代進(jìn)行染色體倍性鑒定以確定雜交是否成功.研究結(jié)果表明：以巨玫瑰葡萄為父本的胚挽救效果最好，胚的發(fā)育率和萌發(fā)率顯著高于以玫瑰香葡萄為父本的數(shù)值；以希姆勞特葡萄為父本的胚發(fā)育率和萌發(fā)率最低，胚挽救效果最差.

由于無核葡萄發(fā)育過程中胚珠有一個(gè)急劇敗育期[18]，因此了解胚珠的敗育時(shí)期適時(shí)接種具有重要意義[19].本研究中3個(gè)雜交組合授粉后54 d 和68 d 的胚發(fā)育率和萌發(fā)率均顯著低于授粉后61 d 的數(shù)值，即最佳取樣時(shí)間為授粉后61 d，此時(shí)紅寶石無核×巨玫瑰的雜交胚發(fā)育率和萌發(fā)率均顯著高于其余2個(gè)雜交組合的胚發(fā)育率和萌發(fā)率.適宜的培養(yǎng)基是影響胚生長(zhǎng)發(fā)育的另一個(gè)重要因素. 本研究比較了E1 和N12 種發(fā)育培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)后者更適宜于胚的生長(zhǎng)發(fā)育.比較紅寶石無核×希姆勞特和紅寶石無核×玫瑰香2個(gè)雜交組合的離體胚珠分別在2 種發(fā)育培養(yǎng)基上的胚發(fā)育率，發(fā)現(xiàn)紅寶石無核×玫瑰香的發(fā)育優(yōu)勢(shì)顯著.將2個(gè)組合的離體胚在W1 和M1培養(yǎng)基上萌發(fā)培養(yǎng)60 d 后，發(fā)現(xiàn)W1 培養(yǎng)基更適合紅寶石無核×希姆勞特離體胚的萌發(fā)培養(yǎng)，紅寶石無核×玫瑰香組合在M1 培養(yǎng)基上的胚萌發(fā)效果較好，但在W1 培養(yǎng)基上的成苗情況較好.