人參親環素蛋白原核表達及其抗真菌活性

李帥軍，才可新，張楠楠，孫天霞，趙　雨，曲　毅,2*

(1.長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，長春 130117;2.吉林省食品藥品安全監測中心，長春 130033)

人參親環素蛋白原核表達及其抗真菌活性

李帥軍1，才可新1，張楠楠1，孫天霞1，趙雨1，曲毅1,2*

(1.長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，長春 130117;2.吉林省食品藥品安全監測中心，長春 130033)

摘要：目的研究人參親環素蛋白(pgCyP)體外抗真菌活性。方法采用RT-PCR技術,擴增人參cyclophilin(pgCyP)基因片段，構建原核表達質粒并轉入大腸桿菌中，利用IPTG誘導表達目的蛋白，通過親和純化獲得pgCyP蛋白，紙片擴散法驗證目的蛋白的抗菌活性。結果人參CyP基因全長為522個堿基,編碼174個氨基酸；目的蛋白經純化后,SDS-PAGE分析顯示單一條帶;抑菌試驗表明該重組蛋白可明顯抑制疫霉菌菌絲的生長。結論成功克隆并表達具有抗菌活性的pgCyP蛋白,為進一步研究pgCyP在人參抗真菌中的作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：親環素；人參；原核表達；純化；抗真菌活性

目前，人們已經從植物中分離出了許多抗菌蛋白如幾丁質、親環素、防御素凝集素和脂質轉移蛋白等[1-6]。親環素(CyP)是一類免疫因子，可以和免疫抑制劑環孢素A特異性結合[7]，廣泛存在于各種生物體，具有PPIase活性，能催化Xaa-Pro肽鍵異構化，在多種生理活動中發揮重要的作用[8]。目前已發現親環素對多種真菌具有抑制能力，許多親環素類抗真菌蛋白已經從黑臍豆、綠豆、白菜和鷹嘴豆等植物中鑒定獲得[9-11]。本研究通過構建人參親環素原核表達載體，并針對目的蛋白進行抗疫霉菌生物活性研究，為今后人參抗病害研究提供技術支撐。

1材料

1.1材料5年生人參(PanaxginsengC.A Meyer)樣品采自吉林省撫松縣人參種植產業基地；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)本實驗室保存；人參疫病(Phytophthora cactorum)由吉林農業大學中藥材學院韓梅教授提供并鑒定；載體pGEX-6p-1由吉林大學生命科學院提供；Ni-chelating sepharose FF購自美國GE公司。

1.2試劑T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH I、Not I、RT-PCR試劑盒購自TakaRa生物工程(大連)有限公司。

2方法

2.1人參CyP原核表達質粒構建根據人參CyP(pgCyP)基因的cDNA序列設計特異性引物上游5’- CGGATCCATGGCCAACCCAA-3 ’，下游引物5’- ATT

TGCGGCCGCGTGGTG，GTGGTGGTGGTGCTCGAG-3’，PCR擴增，將擴增片段連接到pMDTM18-T并進行測序，BamH I和Not I雙酶切，將目的基因連接到表達載體pGEX-6p-1，獲得重組質粒pGEX-6p-1-pgCyP，質粒鑒定后轉化BL21(DE3)。

2.2誘導表達將陽性克隆菌株接種到20 mL LB(Ampicillin)培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩過夜，然后按1%(V/V)接種量轉接至100 mL LB(Ampicillin)培養基中，振蕩培養至OD600到0.6-0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃，200 r/min振蕩誘導5 h，離心取沉淀。分別對誘導前和誘導后菌沉淀進行SDS-PAGE分析。

2.3蛋白純化誘導后菌離心，取沉淀重懸于Wash Buffer，4 ℃低溫離心后，沉淀重懸于Lysis Buffer，加入適量的DNase I( 濃度為2 000 U/mL )冰浴超聲30 min。將菌體裂解液以10 000×g，4 ℃離心20 min。棄上清收集包涵體并使用變性劑溶解；透析復性后，包涵體溶解液上清用0.2 μM濾膜過濾，Ni-chelating sepharose FF親和層析柱純化蛋白，用含100、500 mmol/L咪唑的Elution Buffer分別洗脫蛋白，收集洗脫流穿峰，最后用SephadexG-25 除鹽柱脫鹽處理，采用Bradford方法測定目的蛋白濃度。

2.4體外抗菌活性實驗將疫霉菌接種在PDB培養液中，28 ℃培養3 d后，用121 ℃高溫滅菌的8層紗布收集真菌孢子液，取經滅菌水稀釋至一定濃度的孢子液80 μL轉移至96孔板中，后在孔中加20 μL一定濃度的蛋白溶液，以加入GST載體蛋白和緩沖液為對照，28 ℃ 恒溫培養24 h。根據菌液OD值繪制生長曲線，判斷真菌對pgCyP蛋白的敏感程度。

3結果

3.1pgCyP原核表達載體構建及鑒定結果表明，基因全長522 bp，編碼174個氨基酸。基因片段連入pGEX-6P-1載體并擴增，質粒經BamH I和Not I雙酶切鑒定，獲得約520 bp和4.9 kb兩條帶(見圖1)，大小與目的片段和載體片段相符。

3.2誘導表達及純化結果表明，在約46 kDa處有明顯的條帶(圖2泳道3)，而且以包涵體形式高表達(圖2泳道5)。結果符合預期。經Ni親和層析純化后，獲得了純度較高的重組蛋白(圖2 泳道9)。

3.3蛋白對真菌的抑制試驗結果顯示，重組蛋白對疫霉菌具有明顯的抑制作用，半抑制率的濃度為2.55 μmol/L。

1 DNA Maker　2 質粒pGEX-6p-1-pgCyP雙酶切圖1　質粒酶切鑒定

1 Pr Maker　2 pGEX-6P-1　3 誘導菌體　4 菌體裂解上清5 菌體裂解沉淀　6 包涵體溶解液　7 蛋白循環上樣后8 蛋白純化后流穿　9 純化后洗脫收集液圖2　蛋白表達純化

4小結

本課題組在前期工作中已應用Illumina Hiseq-2000高通量測序技術建立了人參葉片轉錄組數據庫，通過數據分析，發現了一條cDNA序列為親環素基因，并且該基因的轉錄水平與人參易患病時期密切相關。推測人參親環素在人參患病時期高表達，很可能是一種抗真菌蛋白。實驗中得到了人參親環素的全長基因，對于今后從基因表達水平方面研究親環素基因在人參的生長發育及代謝過程中的作用具有重要意義。利用pGEX-6P-1作為表達載體，成功構建了人參親環素原核表達體系，并在大腸桿菌中實現了融合蛋白表達。在插入片段C端插入6個組氨酸標簽，為下游分離純化親環素蛋白提供了良好條件。純化的重組蛋白也為未來制備人參親環素抗體提供了實驗材料。

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Prokaryotic expression of ginseng cyclophilin and the detected of antifungal activity

LI Shuaijun1,CAI Kexin1,ZHANG Nannan1,SUN Tianxia1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveWe investigated the antifungal activity of panax ginseng cyclophilin (pgCyP) in vitro.MethodsIn this study,we amplified pgCyP gene by RT-PCR,constructed prokaryotic expression plasmid and transformed into E.Coli.Target protein was induced by IPTG and affinity purified.Disc diffusion method was used to verify the antifungal activity of target protein.ResultsThe full length of pgCyP gene is 522 bp,which codes for a protein 174 amino acids in length.After purified,the target protein showed a single band in SDS-PAGE.Antifungal test showed that the recombinant protein can obviously inhibit the growth of the Phytophthora cactorum.ConclusionpgCyP was successfully cloned,expressed and antifungal activity characterization,which provides foundation for further research of pgCyP antifungal mechanism.

Keywords：Cyclophilin;Panax ginseng;prokaryotic expression;purification;antifungal activity

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.009

基金項目：吉林省經濟結構戰略調整引導資金專項項目(2014N155)。

作者簡介：李帥軍(1987-),男,碩士研究生,主要從事中藥學研究。

*通信作者：曲毅,女，博士，助理研究員，電話-(0431)86172300，電子信箱-quyi1229@163.com

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2016)03-0464-03

收稿日期:(本欄責任編輯：張海洋2016-03-21)