葫蘆素E抑制多發性骨髓瘤細胞增殖及與阿霉素的協同效應*

楊瑪麗，肖　翠，魏　榕，伍忠軍，曹小華，王莎莎，陽　泰，李敏惠，劉　進△

1.成都醫學院 檢驗醫學院(成都　610500)；2.成都醫學院 生物醫學系(成都　610500)；3.成都醫學院 科研實驗中心(成都　610500)

葫蘆素E抑制多發性骨髓瘤細胞增殖及與阿霉素的協同效應*

楊瑪麗1，肖翠2，魏榕2，伍忠軍2，曹小華2，王莎莎2，陽泰3，李敏惠3，劉進3△

1.成都醫學院 檢驗醫學院(成都610500)；2.成都醫學院 生物醫學系(成都610500)；3.成都醫學院 科研實驗中心(成都610500)

【摘要】目的研究葫蘆素E對人多發性骨髓瘤細胞增殖和凋亡的影響，并觀察葫蘆素E與阿霉素的協同效應。方法采用CCK-8測定葫蘆素E對4種多發性骨髓瘤細胞MM1.S、MM1.R、U266和RPMI8226的半數生長抑制率(GI50)，并通過CalcuSyn協同效應分析軟件，計算藥物合用指數(CI)，評價葫蘆素E與阿霉素協同抗多發性骨髓瘤作用；流式細胞術檢測葫蘆素E對MM1.S、MM1.R的細胞周期、線粒體膜電位和細胞凋亡的影響；Western blot檢測凋亡相關蛋白Caspase-3和PARP的變化，以及葫蘆素E對IL-10刺激的RPMI8226細胞STAT3蛋白磷酸化的抑制作用。結果葫蘆素E對4種多發性骨髓瘤細胞的GI50均在(12.3～161.7) nM范圍內；葫蘆素E導致多發性骨髓瘤細胞的SubG1期細胞比例、凋亡細胞比例和線粒體膜電位下降細胞比例均明顯增加，并出現凋亡相關的活化蛋白如Cleaved Caspase-3 和Cleaved-PARP。葫蘆素E能有效抑制IL-10誘導的RPMI8226細胞STAT3磷酸化，并能與阿霉素協同抗多發性骨髓瘤。結論葫蘆素E通過抑制STAT3蛋白磷酸化，誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡，并能協同阿霉素抗多發性骨髓瘤。

【關鍵詞】葫蘆素E；阿霉素；STAT3；多發性骨髓瘤；凋亡；協同效應

葫蘆素E(Cucurbitacin E，CuE)是從葫蘆科等植物中分離得到的一種四環三萜類化合物，具有保肝、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性。在20世紀70～80年代，我國已研發出葫蘆素片(含葫蘆素B和CuE)，用于肝炎和肝癌的治療[1]。CuE可抑制RAW264.7細胞的NF-κB核轉位，發揮抗炎作用[2]；CuE能阻滯乳腺癌細胞周期在G2/M期，并誘導凋亡，通過抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，從而抑制乳腺腫瘤轉移[3-4]。另外，CuE還能通過抑制VEGFR2介導的JAK2-STAT3信號通路，抑制腫瘤血管生成[5]。

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞系惡性腫瘤，目前無法完全治愈，但近年來，通過傳統化療藥物與新型靶向藥物聯合用藥，極大地改善了MM的治療效果[6]。有文獻[7]報道，CuE能增加阿霉素在M5076卵巢肉瘤細胞中的濃度，但不會增加阿霉素的毒副反應。因此，研究CuE對MM細胞的增殖抑制及與阿霉素的協同效應，可為阿霉素聯合用藥抗MM提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

CuE(純度 ≥ 98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；阿霉素和線粒體膜電位試劑盒購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；細胞周期即時檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司；IL-10購自美國Ebioscience公司；兔抗人Caspase-3、PARP抗體以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗購自CST公司；RIPA細胞裂解液、PVDF膜和ECL化學發光試劑購自Millipore公司；美國Becton Dickinson公司Accuri C6流式細胞儀；美國Biotek公司PowerWave XS全波長酶標儀。

1.2細胞培養

MM1.S、MM1.R、U266和PRMI8226 4種人MM細胞購自ATCC(美國標準生物品收藏中心)。MM細胞于5% CO2和37 ℃環境中，使用含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 μg /L硫酸鏈霉素的RPMI1640培養基培養。

1.3CCK-8法檢測細胞增殖

測定CuE對細胞增殖的抑制率。MM1.S、MM1.R、U266以及PRMI8226 4種人MM細胞按照200 μL，5 × 104個/孔細胞密度，接種于96孔平底細胞培養板，不同濃度梯度CuE作用48 h后，加入10 μL CCK-8，培養6 h后，使用酶標儀測定在450 nm波長光吸收值。藥物對腫瘤細胞生長抑制率按照美國國家癌癥研究所標準計算：當Ti≥Tz，腫瘤細胞存活率=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100；當Ti < Tz，腫瘤細胞存活率=[(Ti-Tz)/Tz]×100(Ti為藥物組培養48 h后，測定的OD值；Tz為不含藥物組，起始培養測定的OD值；C為不含藥物組，培養48 h后測定的OD值)。

1.4CuE與阿霉素協同抗MM1.S細胞作用檢測

將MM1.S細胞按照200 μL/孔，5 × 104個/孔細胞密度，接種于96孔平底細胞培養板，CuE與阿霉素設置25、50、100、200 nM 4個濃度梯度。設置CuE單獨加藥組、阿霉素單獨加藥組和聯合用藥組(CuE與阿霉素濃度相同)。藥物作用72 h后，按照1.3所述步驟，測定腫瘤細胞存活率。使用CalcuSyn協同效應分析軟件，計算CuE與阿霉素的合用指數(CI)值(CI>1，為拮抗作用；CI=1，為相加作用；CI<1，為協同作用)。

1.5細胞周期、細胞凋亡與線粒體膜電位檢測

MM1.R和MM1.S細胞按照1×106個/mL，2 mL/孔，加入12孔細胞培養板，CuE藥物濃度為200、100 nM和50 nM。藥物作用8 h后，收集細胞，使用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測細胞線粒體膜電位。藥物作用24 h后，收集細胞，使用細胞周期檢測試劑盒和Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，分別檢測細胞周期和細胞凋亡。按照試劑盒說明書進行操作，使用BD公司Accuri C6流式細胞儀進行檢測，每個樣品采集10 000個細胞，使用BD Accuri C6 software 1.0.264.21分析實驗數據。

1.6Western blot檢測Caspase-3、PARP、p-STAT3和STAT3蛋白

MM1.R和MM1.S細胞按照1×106個/mL，4 mL/孔， 加入6孔細胞培養板，CuE 作用濃度為 100 nM和 50 nM，培養 6 h，收集細胞，冰上裂解30 min， 使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，80 μg/泳道，PVDF膜濕轉300 mA， 1 h。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入一抗(Caspase-3、Cleaved Caspase3、p-STAT3、STAT3和PARP)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次；加入二抗(HRP標記的羊抗兔)，37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次，使用化學發光成像儀檢測。

1.7統計學分析

2結果

2.1CuE對4種人MM細胞增殖的抑制作用

不同濃度梯度CuE作用4種人MM細胞48 h后，通過CCK-8測定CuE對人MM細胞的GI50。CuE對MM1.S、MM1.R、U266和RPMI8226 4種細胞表現出明顯的增殖抑制作用，GI50均在12.3～161.7 nM范圍內(圖1B)。

2.2CuE與阿霉素協同抗MM

通過CCK-8測定各組藥物作用MM1.S細胞72 h后的細胞存活率，CuE與阿霉素合用組的細胞存活率均低于CuE或阿霉素單獨用藥組(圖1C)。

圖1葫蘆素E抑制4種人MM細胞增殖并能與阿霉素產生協同作用

注：A.CuE化學結構式；B.CuE對4種人MM細胞生長抑制曲線和GI50；C.CuE、阿霉素以及兩種藥物合用時，MM1.S細胞的存活率(**P<0.01)；D.CuE與阿霉素聯合用藥抗MM1.S細胞的協同效應

使用混合藥物分析軟件Calcusyn計算CuE與阿霉素的藥物CI值。當Fractional Effect>0.6時，CI<1， 說明CuE與阿霉素具有協同作用(圖1D)。

2.3CuE對MM1.S和MM1.R細胞周期的影響

MM1.S與MM1.R細胞經CuE 100 nM作用24 h后，檢測細胞周期，結果表明，CuE處理后，細胞周期處于 SubG1期的細胞比例明顯增加。MM1.S的SubG1期細胞比例由2.0%增加為15.1%，MM1.R的SubG1期細胞比例由2.1%增加為25.2%(圖 2)。

圖2CuE對MM1.S和MM1.R細胞周期的影響

2.4CuE誘導MM1.S和MM1.R細胞凋亡

MM1.S與MM1.R細胞經不同濃度CuE作用24 h后，通過Annexin-V和PI雙染檢測細胞凋亡。CuE濃度為50、100、200 nM時，均能誘導MM1.S與MM1.R細胞發生凋亡，凋亡和死亡細胞比例明顯增加(圖 3)。

圖3CuE誘導MM1.S和MM1.R細胞凋亡

2.5CuE降低MM1.S和MM1.R的線粒體膜電位

MM1.S與MM1.R細胞經不同濃度CuE作用8 h后，使用JC-1檢測細胞線粒體膜電位。與空白對照組相比，經CuE 200 nM作用的MM1.S與MM1.R細胞，線粒體膜電位降低的細胞比例明顯增加，纈氨霉素為陽性對照(圖 4)。

2.6CuE導致MM細胞激活Caspase-3和產生PARP剪切體

MM1.S與MM1.R細胞經不同濃度CuE作用6 h后，收集并裂解細胞，制備蛋白樣品。Western blot檢測Caspase-3和PARP蛋白。經CuE處理后的細胞，出現了明顯的Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白條帶(圖 5)。

圖4CuE對MM1.S和MM1.R細胞線粒體膜電位的影響

圖5CuE導致MM1.S和MM1.R細胞激活Caspase-3并產生PARP剪切體

2.7CuE抑制IL-10誘導的細胞STAT3磷酸化

RPMI8226細胞經CuE作用6 h后，加入IL-10刺激10 min，收集細胞制備蛋白樣品。Western blot檢測，CuE 濃度為1 μM能明顯抑制STAT3磷酸化，濃度5 μM能完全抑制STAT3磷酸化。Ruxolitinib作為STAT3抑制劑對照[8](圖 6)。

圖6CuE抑制RPMI8226細胞STAT3磷酸化

3討論

CuE對4種人MM細胞MM1.S、MM1.R、U266和RPMI8226均有較好的抑制活性，GI50在12.3～161.7 nM范圍內。在有效濃度范圍內，測定CuE對MM細胞的細胞周期、細胞凋亡、線粒體膜電位、Caspase-3、PARP和STAT3蛋白的影響，結果顯示：CuE處理組與空白對照組相比，SubG1期細胞比例、凋亡細胞比例和線粒體膜電位下降細胞比例均明顯增加。經CuE處理后，可在MM細胞中檢測到Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白。以上結果表明，CuE通過激活Capase和降低線粒體膜電位，誘導MM細胞凋亡，而細胞凋亡導致胞內DNA降解，形成亞二倍體細胞，SubG1期細胞比例增加。

本研究還發現，CuE可以抑制IL-10誘導的RPMI8226細胞STAT3磷酸化。既往研究[9]發現，克拉屈濱與STAT3抑制劑聯用比單用兩種藥

物更能明顯誘導U266、RPMI8226和 MM1.S 3種MM細胞凋亡。這與本研究發現類似，阿霉素與CuE合用抗MM，比單用阿霉素或CuE作用更強。推測CuE與阿霉素的協同作用可能和CuE抑制STAT3磷酸化有關。另外，CuE與阿霉素的協同作用還可能和CuE增加腫瘤細胞中阿霉素的濃度有關[7]。

綜上所述，CuE能通過抑制STAT3活性，激活Capase和降低線粒體膜電位，誘導MM細胞凋亡。由于CuE的抗MM細胞增殖活性及與阿霉素的協同效應，CuE有可能被用于阿霉素聯合用藥治療MM。

參考文獻

[1] Chen X,Bao J,Guo J,etal.Biological activities and potential molecular targets of cucurbitacins: a focus on cancer[J].Anticancer Drugs,2012,23(8):777-787.

[2] Qiao J,Xu LH,He J,etal.Cucurbitacin E exhibits anti-inflammatory effect in RAW 264.7 cells via suppression of NF-κB nuclear translocation[J].Inflamm Res,2013,62(5):461-469.

[3] Kong Y,Chen J,Zhou Z,etal.Cucurbitacin E induces cell cycle G2/M phase arrest and apoptosis in triple negative breast cancer[J].PLoS One,2014,9(7):e103760.

[4] Zhang T,Li J,Dong Y,etal.Cucurbitacin E inhibits breast tumor metastasis by suppressing cell migration and invasion[J].Breast Cancer Res Treat,2012,135(2):445-458.

[5] Dong Y,Lu B,Zhang X,etal.Cucurbitacin E,a tetracyclic triterpenes compound from Chinese medicine,inhibits tumor angiogenesis through VEGFR2-mediated Jak2-STAT3 signaling pathway[J].Carcinogenesis,2010,31(12):2097-2104.

[6] 中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會抗淋巴瘤聯盟,中國抗癌協會淋巴瘤專業委員會,中華血液學會白血病淋巴瘤組,等.脂質體阿霉素治療惡性淋巴瘤及多發性骨髓瘤的中國專家共識[J].中國腫瘤臨床,2014,41(24):1550-1555.

[7] Sadzuka Y,Hatakeyama H,Sonobe T.Enhancement of doxorubicin concentration in the M5076 ovarian sarcoma cells by cucurbitacin E co-treatment[J].International Journal of Pharmaceutics,2010,383(1-2):186-191.

[8] Pattison MJ,MacKenzie KF,Arthur JS.Inhibition of JAKs in Macrophages Increases Lipopolysaccharide-Induced Cytokine Production by Blocking IL-10-Mediated Feedback[J].The Journal of Immunology,2012,189(6):2784-2792.

[9] Ma J,Wang S,Zhao M,etal.Therapeutic potential of cladribine in combination with STAT3 inhibitor against multiple myeloma[J].BMC Cancer,2011,11(1):255.

The Antiproliferative Effect of Cucurbitacin E on Human Multiple Myeloma Cells and Its Synergistic Effect in Combination with Adriamycin

YangMali1,XiaoCui2,WeiRong2,WuZhongJun2,CaoXiaohua2,WangShasha2,YangTai3,LiMinhui3,LiuJin3△.

1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.CenterforScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

【Abstract】ObjectiveTo detect the effect of cucurbitacin E (CuE) on the proliferation and apoptosis of human mulitiple myeloma (MM) cells,and to investigate the synergistic effect of CuE combined with adriamycin on MM cells. MethodsThe CCK-8 assay was used to measure the growth inhibition of 50%(GI50)of CuE on the four MM cell lines including MM1.S,MM1.R,U266 and RPMI8226.The synergistic effect of CuE combined with Adriamycin on MM cells was assessed by calculating combination index (CI) with the help of CalcuSyn software (Biosoft,Cambridge,UK). The flow cytometer was used to measure the effect of CuE on cell cycles, mitochondrial membrane potential and cell apoptosis, and the Western-blot was adopted to detect the changes of Caspase-3 and PARP and the inhibition effect of CuE on STAT3 phosphorylation induced by IL-10. ResultsThe GI50 of CuE on the four MM cell lines ranged from 12.3 nM to 161.7 nM. CuE significantly increased the number of the cells in the subG1 phase and the percentage of apoptotic cells, but reduced the mitochondrial membrane potential of MM cells. Meanwhile, Cleaved Caspase-3 and cleaved PARP were detected in MM cells. CuE had a great inhibition effect on the STAT3 phosphorylation in MM cells induced by IL-10 and a synergistic effect on human multiple myeloma in combination with Adriamycin. ConclusionCuE can induce the apoptosis of MM cells by inhibiting the phosphorylation of STAT3, and have a synergistic effect of anti-multiple myeloma by working with Adriamycin.

【Key words】Cucurbitacin E; Adriamycin; STAT3; Multiple myeloma; Apoptosis; Synergistic effect

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.003

基金項目：＊國家自然科學基金項目(No：81201668)；四川省教育廳基金項目(No：15ZB0234)；四川省衛生廳基金項目(No:130302)；四川省大學生創新創業訓練計劃項目(No：201413705032)

通信作者：△劉進，E-mail：jinliu19871987@163.com

【中圖分類號】R733.3

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1557.032.html

·論著·