丹參水溶性物質SA—B對TGF—β1活化細胞內Smad與p38MAPK信號傳導通路的抑制作用

李展城 蔡大可 舒友平 千永香

【摘要】目的：探究丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1活化細胞內Smad與p38MAPK信號傳導通路的抑制作用。方法：將腎小管上皮細胞培養液中加入不同的藥物，誘導組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進行誘導；實驗A1、A2、A3組，在誘導組的基礎上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質SA-B；對照組不加任何藥物。細胞培養24、48、72h后檢測各組的TGF-β1-mRND水平、培養液中TGF-β1的含量、Smad以及p38MAPK的表達進行，記錄檢測結果。結果：誘導組的TGF-β1-mRND水平、TGF-β1蛋白含量分泌與對照組相比，均具有統計學意義（P<0.05），且實驗組的同期誘導組相比，水平顯著下降（P<0.05）。誘導組的Smad與p38MAPK合成趨勢明顯，而實驗組Smad與p38MAPK的表達呈現下降趨勢。結論：丹參的水溶性物質-SA-B對TGF-β1活化細胞內Smad與p38MAPK信號傳導通路具有顯著的抑制作用。

【關鍵詞】丹參水溶性物質SA-B；TGF-β1；Smad；p38MAPK

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）09-0018-02

研究發現，丹參水溶性物質SA-B對于TGF-β1活化細胞內Smad與p38MAPK信號傳導通路具有顯著的抑制作用，表明丹參水溶性物質SA-B在降低腎組織轉化因子-β1（TGF-β1）水平的過度表達方面，具有顯著的抑制作用[1]。研究采用丹參水溶性物質SA-B，并借助馬兜鈴酸誘導的腎小管上皮細胞TGF-β1，探究丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1活化細胞內Smad與p38MAPK的抑制作用。

1材料與方法

1.1試劑與藥品丹參水溶性物質SA-B（批號：111871-201001，中國藥品生物制品檢定所），實驗時配置成濃度分別為5、10、20μg/ml的三種試劑進行使用。TGF-β1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；抗Smad抗體（美國CST公司）；抗p38MAPK抗體（美國CST公司）。腎小管上皮組織細胞。

1.2實驗方法將腎小管上皮細胞用含2%胎牛血清的K-SFM培養液進行培養，取第6～7代細胞進行試驗。當細胞生長到80%融合時，更換無血清培養液[2]。12h以后進行細胞分組。誘導組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進行誘導；實驗組：分成A1、A2、A3三個小組，在誘導組的基礎上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質SA-B；對照組不加任何藥物。觀察不同劑量的丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1、Smad以及p38MAPK表達水平的影響。

1.3測定方法①采用熒光定量PCR檢測TGF-β1-mRND水平。②ELISA檢測培養液中TGF-β1的含量，吸取培養液后分析取上清，并按照ELISA試劑盒的說明進行操作，采用酶標儀讀取吸光度，并計算TGF-β1的含量。③用免疫印跡法檢測Smad以及p38MAPK的表達，在細胞分裂后提取蛋白定量，加入Smad抗體（1∶[KG-*3/5]400）與p38MAPK（1∶[KG-*3/5]400）抗體；過夜以后將HRP標記的IgG（1∶[KG-*3/5]500）加入[3]。放置1h后將ECL液加入，顯影后在暗室曝光，最后進行圖像分析。以上三種測定方式，分別在每組細胞培養24、48、72h后進行，記錄檢測結果。

1.4統計學方法數據采用SPSS 20.0統計學軟件進行處理，計量資料采用均數士標準差（x[TX-*3]±s）的形式表示，采用t檢驗；計數資料用率（%）表示，用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1-mRND水平表達的影響誘導組的TGF-β1-mRND水平在刺激24、48h后持續上升，72h有所降低，但仍處于高水平，與對照組相比，P<0.05；實驗組在采用丹參水溶性物質SA-B進行干預24、48h后，TGF-β1-mRND水平顯著下降，與誘導組相比，P<0.05；且在48h以后，TGF-β1-mRND的下降水平更加明顯（P<0.05）。見表1。

2.2丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1蛋白含量的影響誘導組的TGF-β1蛋白含量分泌增加，與對照組相比，P<0.05；在72h有所降低，但仍顯著高于對照組（P<0.05）；而實驗組的TGF-β1蛋白含量與同時期的誘導組相比，顯著下降。且在48h以后，丹參水溶性物質SA-B對TGF-β1的抑制作用隨著用量的增加而加強。見表2。

2.3丹參水溶性物質SA-B對Smad與p38MAPK表達的影響誘導組的Smad與p38MAPK合成趨勢明顯，而實驗組在采用丹參水溶性物質SA-B干預后，Smad與p38MAPK的表達呈現下降趨勢。且在72h后，Smad與p38MAPK的高表達持續下降。見表3 。

3討論

丹參是臨床較為常見的一種藥材，在消炎、抗菌、抗凝血方面，具有顯著的作用，臨床上主要用于心血管系統、神經神經的保護[4]。丹參酸是丹參中的水溶性活性成分，其中以丹參酸A和丹參酸B的活性最強，在抗脂質過氧化、清除氧自由基、保護心臟、心腦血管、防治動脈粥樣硬化、抗腫瘤等方面有顯著的生物活性，常用于心肌缺血再灌注損傷、心臟微血管內皮細胞等的保護中。實驗表明，丹參酸B在抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的鈣離子超載、改善血栓素/前列環素（TXA2/PGI2）平衡系統、減少內皮素（ET）及腫瘤壞死因子a（TNF-a）的釋放、降低缺氧/復氧損傷后內皮細胞細胞間粘附分子的表達方面具有顯著作用。此外，丹參的水溶性物質SA-B對于降低腎組織TGF-β1的過度表達，抑制腎小管上皮細胞的轉分化與纖維化等具有顯著的作用[5]。研究結果顯示，丹參的水溶性物質SA-B對于降低TGF-β1-mRND表達、抑制TGF-β1蛋白含量分泌具有顯著的作用，且對于TGF-β1活性細胞中的Smad與p38MAPK過量表達也有顯著的抑制作用。

綜上所述，丹參的水溶性物質SA-B能夠抑制TGF-β1活化細胞的蛋白質含量分泌，對于細胞內的Smad與p38MAPK也具有顯著的抑制作用。

參考文獻

[1]劉成海，劉平，胡義揚，等.丹酚酸B鹽對轉化生長因子-β1刺激肝星狀細胞活化與胞內信號轉導的作用[J].中華醫學雜志，2002，82（18）：1267-1272.

[2]楊佳，張毅，秦彩玲，等.丹參、三七的有效部位對正常大鼠血小板粘聚性及TXA2、PGI2的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2004，10（5）：21-24.

[3]武子朝，韓瑞旸，朱建彪，等.丹酚酸B通過抑制線粒體功能增加膠質瘤細胞的放療敏感性[J].現代生物醫學進展，2015，15（9）：1636-1639.

[4]吳甜鶯，張雄，鄭永克，等.電針聯合丹酚酸B治療對衰老模型大鼠記憶障礙的影響[J].中華物理醫學與康復雜志，2015，37（6）：467-469.

[5]陶艷艷，王曉玲，劉成海，等.丹酚酸B對NIH/3T3成纖維細胞TGF-β1/ERK胞內信號轉導的影響[J].首都醫科大學學報，2007，28（2）：192-195.

（收稿日期：2016.03.17）