C- 反應蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鑒定

葛歐洋，劉青，李曉曦，林艷，譚文，趙子建

(1.南京醫(yī)科大學 代謝疾病研究中心，江蘇 南京　210029; 2.華南理工大學

C- 反應蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鑒定

葛歐洋1，劉青2，李曉曦1，林艷1，譚文2，趙子建1

(1.南京醫(yī)科大學 代謝疾病研究中心，江蘇 南京210029; 2.華南理工大學

生物科學與工程學院前孵化器中心，廣東 廣州510006)

[摘要]目的：繁育及鑒定C- 反應蛋白(CRP)全身性敲除的大鼠模型。方法：通過TALEN技術(shù)構(gòu)建CRP敲除的雜合子大鼠，并將F1代雌鼠與雄鼠相互交配得到F2代大鼠。通過DNA測序以及ELISA法鑒定CRP敲除大鼠。結(jié)果：通過測序發(fā)現(xiàn)CRP敲除大鼠的CRP基因1#外顯子缺失了TTGGT共5個堿基，ELISA結(jié)果顯示CRP敲除大鼠中血清CRP含量較野生型相比下調(diào)98%。結(jié)論：成功構(gòu)建了CRP全身性敲除大鼠，為后期CRP生物學功能的相關研究提供了動物模型。

[關鍵詞]C- 反應蛋白； 全身性敲除； 繁育； 大鼠

C- 反應蛋白(CRP)首次被發(fā)現(xiàn)是在1930年，在體內(nèi)主要是由肝臟合成[1]。它由5個24 kD頓原聚體(含206個氨基酸)以非共價連結(jié)成為五元體環(huán)形結(jié)構(gòu)。CRP會結(jié)合在死亡細胞或微生物外膜上的磷酸膽堿(phosphocholine)，以活化補體系統(tǒng)。當體內(nèi)有急性炎癥、細菌感染、組織的損傷時，CRP的濃度會隨著白介素- 6(IL- 6)的升高而升高。而IL- 6的升高又與某些炎癥疾病的預后相關[2]。細胞學實驗證明，CRP通過與凋亡細胞表面的溶血卵磷脂結(jié)合在C1Q復合物介導下激活補體系統(tǒng)[3]。CRP并不適用于單一疾病的診斷，它的臨床價值主要在于組織損傷的篩檢和監(jiān)測，或者判斷病人是否發(fā)炎以及診斷發(fā)炎性疾病的復發(fā)，除了肝臟衰竭的病人以外很少有干擾因素會影響CRP在血清中的濃度[4]。

自1997年起，美國布里根婦女醫(yī)院的心臟學家瑞德克就注意到，一種和發(fā)炎有關的分子CRP與心臟病有關[5]。近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CRP基礎水平升高的人群中糖尿病[6- 7]、高血壓和心血管疾病的發(fā)病風險明顯增加。同時，CRP還可作為肺動脈高壓的預后判斷指標[8]。一項關于冠心病的Meta分析涉及20項研究和1 466例患者，此外還有研究發(fā)現(xiàn)CRP可能是動脈粥樣硬化的保護性蛋白。在體外試驗中它可以結(jié)合到死亡細胞染色質(zhì)和細胞碎片，因此推測它有阻止血小板聚集、減少血栓形成的作用。還有研究顯示，CRP可以結(jié)合低密度脂蛋白(LDL)，通過吞噬細胞表面受體將LDL清除出動脈粥樣硬化的斑塊區(qū)[9]。

雖然有大量的臨床研究證明CRP與炎癥應答以及冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生有相關，但是卻沒有系統(tǒng)的功能方面的研究[10]。因此我們委托賽業(yè)生物有限公司用TALEN(transcription activator- like effector nuclease)的方法構(gòu)建CRP敲除的大鼠，為研究CRP在各種相關疾病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用提供動物模型。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑

大鼠基因組DNA提取與純化試劑盒購自北京全式金生物科技公司。所用T4 DNA 連接酶、DNA聚合酶、Taq酶及 PCR 相關試劑主要購自TaKaRa公司。DNA Marker購自TaKaRa公司。大鼠CRP ELISA檢測試劑盒購自默克密理博公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列見表1。所有敲除大鼠的遺傳背景均為SD大鼠，大鼠CRP DNA序列查自NCBI網(wǎng)站。

表1大鼠CRP基因1#外顯子引物序列

Tab 1Primer sequence of rat CRP exon 1#

引物序列引物FTGCCCTTGATCTTTCAGACAGAGC引物RACACAGTGAAGGCTTCCAGTGGC測序引物TGCCCTTGATCTTTCAGACAGAGC

所有大鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)%、12 h明暗交替環(huán)境中，基礎飼料(購自北京維通利華實驗動物有限公司)喂養(yǎng)。

1.2實驗方法

1.2.1CRP全身敲除大鼠雜合子模型的構(gòu)建TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建、mRNA的體外合成以及mRNA原核顯微注射均由賽業(yè)生物科技有限公司完成。

1.2.2CRP DNA片段測序使用引物F和引物R對CRP的1#外顯子進行PCR擴增，得到444 bp左右的DNA片段，并委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司對該片段進行Sanger測序。

1.2.3CRP的ELISA檢測將大鼠的血液離心后取血清，用1×的洗液將血清稀釋4 000倍，在酶標板上每孔加入100 μl稀釋后的樣品，20～25 ℃孵育30 min后用洗板機洗板5次，每孔加入100 μl的酶標二抗，20～25 ℃孵育30 min后用洗板機洗板5次，每孔加入100 μl底物，20～25 ℃下避光顯色5～10 min后每孔加入100 μl終止液。用酶標儀在吸光值450 nm處讀取數(shù)據(jù)。

1.2.4大鼠體重的測定將3、5、8周齡的大鼠置于電子天平上，讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值，稱重 1 次。若有小數(shù)位，則按照“四舍五入”原則修約。

1.3統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1大鼠的基因型鑒定

將F1代大鼠中雄鼠與雌鼠進行交配得到F2代大鼠，用引物F和引物R對大鼠CRP基因的1#外顯子進行PCR擴增，得到444 bp左右的片段。再將該片段進行Sanger測序，結(jié)果顯示與WT大鼠相比CRP-/-和CRP+/-大鼠在其CRP基因1#外顯子第90個堿基的位置缺少了TTGGT 5個堿基，與CRP-/-大鼠相比CRP+/-大鼠在第90個堿基的位置出現(xiàn)了兩種不同的信號峰，所以判斷為雜合子。見圖1。

圖1F2代大鼠的DNA測序圖譜

Fig 1DNA Sequencing chromatogram of F2 generation rats

2.2大鼠血清CRP的ELISA檢測

將大鼠的血清稀釋后用大鼠CRP的ELISA試劑盒進行蛋白含量測定(每組5只大鼠)，CRP-/-大鼠血清中CRP的含量為(6.928±0.60) μg·ml-1；CRP+/-大鼠血清中CRP的含量為(202.2±29.29) μg·ml-1；WT大鼠血清中CRP的含量為(299.7±40.02) μg·ml-1。其中CRP-/-大鼠血清中CRP含量與WT大鼠相比下調(diào)98%，CRP+/-大鼠血清中CRP含量與WT大鼠相比下調(diào)28%。見圖2。

2.3大鼠的體重測定

對3、5、8周齡左右CRP-/-大鼠進行稱重，與WT組相比，其體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

3討論

人類CRP的命名是由于該蛋白能與肺炎雙球菌細胞壁的C多糖結(jié)合[11]。雖然編碼CRP的基因具有一定多態(tài)性，但是CRP缺失的人卻從未被報道過，這說明CRP在進化過程中極其保守，同時CRP在人類的生存中具有重要的作用。大鼠的CRP與人類的CRP在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，但是大鼠血清中CRP的水平在生理情況下的濃度要遠高于人類和小鼠的CRP水平。另外一點與人類CRP不同的是，大鼠的CRP不會激活補體系統(tǒng)[12]。

a 與WT組相比,P<0.01

圖23種基因型大鼠血清中CRP含量的測定

Fig 2The serum CRP levels in three genotypes rats

圖32種基因型大鼠的體重

Fig 3The body weight of two genotypes rats

在C57BL/6小鼠中CRP敲除并不會影響小鼠的正常生長發(fā)育，這點與CRP敲除的大鼠相似，但CRP在正常小鼠生理情況下幾乎不表達，而在正常大鼠生理情況下血液中含量則為300～600 μg·ml-1，這說明在大鼠體內(nèi)CRP的功能與小鼠有所不同。此外有研究證明CRP并不會對小鼠的動脈粥樣硬化產(chǎn)生促進或者保護的作用[13- 15]，但在肺炎雙球菌以及LPS注射的情況下，CRP缺失小鼠的24 h死亡率明顯高于對照組[16]，這說明CRP在小鼠急性感染的過程中起著至關重要的保護作用。而在CRP缺失的大鼠中是否也存在這樣的現(xiàn)象還需要我們通過后續(xù)的實驗進行進一步的研究。

CRP全身性敲除的雜合子大鼠之間相互交配能夠正常生育純子、雜合子以及野生型大鼠，說明CRP半敲除并不影響大鼠的生育功能。與野生型大鼠相比,在體重、毛色、體溫、進食量方面也并沒有表現(xiàn)出差異。本研究建立了CRP全身性敲除大鼠模型，為研究CRP提供了一個重要的實驗平臺，從而得以在整體動物水平面上研究CRP在不同組織器官中的作用，以及CRP在炎癥反應、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生發(fā)展過程中的生物學功能。CRP 作用機制的進一步探索必然會對臨床上治療糖尿病、心血管疾病以及感染性疾病產(chǎn)生深刻的影響。

[參考文獻]

[1] TILLETT W S,FRANCIS T.Serological reactions in pneumonia with a non- protein somatic fraction of pneumococcus[J].J Exp Med,1930,52(4):561- 571．

[2] 紀國業(yè),王斌,杜江,等.不同時間血液灌流對膿毒癥兔血IL- 6及TNF- α水平的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2011,39(2):129- 133．

[3] THOMPSON D,PEPYS M B,WOOD S P.The physiological structure of human C- reactive protein and its complex with phosphocholine[J].Structure,1999,7(2):169- 177.

[4] PEPYS M B,HIRSCHFIELD G M.C- reactive protein:a critical update[J].J Clin Invest,2003,111(12):1805- 1812.

[5] RIDKER P M,CUSHMAN M,STAMPFER M J,et al.Inflammation,aspirin,and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men[J].N Engl J Med,1997,336(14):973- 979.

[6] DEHGHAN A,KARDYS I,de MAAT M P,et al.Genetic variation,C- reactive protein levels,and incidence of diabetes[J].Diabetes,2007,56(3):872- 878．

[7] PRADHAN A D,MANSON J E,RIFAI N,et al.C- reactive protein,interleukin 6,and risk of developing type 2 diabetes mellitus[J].JAMA,2001,286(3):327- 334．

[8] 洪永青,朱蓉,孟自力.血清炎性因子CRP、IL- 6和TNF- α在慢性阻塞性肺疾病繼發(fā)肺動脈高壓中的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2013(33):27- 31．

[9] CHANG M K,BINDER C J,TORZEWSKI M,et al.C- reactive protein binds to both oxidized LDL and apoptotic cells through recognition of a common ligand:phosphorylcholine of oxidized phospholipids[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(20):13043- 13048．

[10] STRANG F,SCHUNKERT H.C- reactive protein and coronary heart disease:all said- - is not it？[J].Mediators Inflamm,2014,2014:1- 7.

[11] VOLANAKIS J E,KAPLAN M H.Specificity of C- reactive protein for choline phosphate residues of pneumococcal C- polysaccharide[J].Proc Soc Exp Biol Med,1971,136(2):612- 614．

[12] de BEER F C,BALTZ M L,MUNN E A,et al.Isolation and characterization of C- reactive protein and serum amyloid P component in the rat[J].Immunology,1982,45(1):55- 70．

[13] TEUPSER D,WEBER O,RAO T N,et al.No reduction of atherosclerosis in C- reactive protein (CRP)- deficient mice[J].J Biol Chem,2011,286(8):6272- 6279．

[14] TRION A,de MAAT M P,JUKEMA J W,et al.No effect of C- reactive protein on early atherosclerosis development in apolipoprotein E*3- leiden/human C- reactive protein transgenic mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(8):1635- 1640．

[15] HIRSCHFIELD G M,GALLIMORE J R,KAHAN M C,et al.Transgenic human C- reactive protein is not proatherogenic in apolipoprotein E- deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(23):8309- 8314．

[16] SIMONS J P,LOEFFLER J M,AL- SHAWI R,et al.C- reactive protein is essential for innate resistance to pneumococcal infection[J].Immunology,2014,142(3):414- 420．

Breeding and identification of rat C- reactive protein knock out model

GE Ou- yang1，LIU Qing2，LI Xiao- xi1，LIN Yan1，TAN Wen2，ZHAO Zi- jian1

(1.CenterofMetabolicDiseaseResearch，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China; 2.Pre-IncubatorforInnovativeDrugandMedicine，SchoolofBioscienceandBioengineering，SouthChinaUniversityofTechnology，Guangzhou510006，China)

[Abstract]Objective： To breed and identify rat C- reactive protein (CRP) knock out models. Methods: The rat CRP knock out heterozygotes models were constructed with TALEN technology， and F2 generation was got by F1 generation copulation. The identification of rat CRP knock out was done by DNA sequencing and ELISA assays. Results: CRP knock out rats had five bases missing in their exon1#. The CRP level of the knock out rats displayed 98% reduction compared with the wild types. Conclusion: We have successfully constructed CRP knock out rat models, which is critical animals for the studies of biological functions of CRP．

[Key words]C- reactive protein; knock out; breeding rats

[收稿日期]2016- 01- 14[修回日期] 2016- 02- 29

[基金項目]科技部“973”重大科學研究計劃項目(2013CB945200)

[作者簡介]葛歐洋(1989-)，男，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E- mail:goy11@163.com 劉青(1990-)，女，廣東連縣人，在讀博士研究生。E- mail:liuqinggzsd@163.com并列第一作者

[通信作者]趙子建E- mail:azzhao@njmu.edu.cn

[中圖分類號]R- 33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0346- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.012

[引文格式] 葛歐洋,劉青,李曉曦,等.C- 反應蛋白全身性敲除大鼠模型的繁育及鑒定[J].東南大學學報:醫(yī)學版,2016,35(3):346- 349.

·論著·