大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及髓核表型的對(duì)比研究

康新桂，吳小濤，王鋒，時(shí)睿，蔡峰，朱厚毅

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 脊柱外科中心，江蘇 南京　210009)

大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及髓核表型的對(duì)比研究

康新桂1，吳小濤2，王鋒1，時(shí)睿1，蔡峰1，朱厚毅1

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 脊柱外科中心，江蘇 南京210009)

[摘要]目的:對(duì)大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細(xì)胞進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)與觀察，并對(duì)髓核軟骨樣細(xì)胞表型進(jìn)行對(duì)比研究。方法:分別取12周齡Sprague- Dawley(SD)大鼠腰椎與尾椎椎間盤(pán)，用分析天平稱取髓核組織的質(zhì)量。組織貼壁法分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞；倒置相差顯微鏡觀察HE染色的髓核組織及不同代次細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第2代尾椎與腰椎髓核細(xì)胞髓核表型的差異。結(jié)果:腰椎髓核組織總質(zhì)量及單個(gè)節(jié)段的質(zhì)量均顯著低于尾椎(P<0.05)。成功分離培養(yǎng)腰椎與尾椎髓核細(xì)胞。腰椎原代髓核細(xì)胞貼壁時(shí)間及70%融合時(shí)間顯著高于尾椎原代髓核細(xì)胞(P<0.05)；第2代腰椎髓核細(xì)胞中脊索樣細(xì)胞數(shù)量顯著低于尾椎髓核細(xì)胞(P<0.05)。HE染色示尾椎髓核組織中脊索樣細(xì)胞較多，細(xì)胞外基質(zhì)豐富，髓核樣軟骨細(xì)胞數(shù)目較少。第2代腰椎與尾椎髓核細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)PCR示第2代尾椎髓核細(xì)胞與腰椎髓核細(xì)胞相比，前者顯著下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(Hif)2α、aggrecan、Brachyury(T)、細(xì)胞角蛋白(Krt)8、Krt18及Krt19的表達(dá)(P<0.05)，且Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的下調(diào)量更明顯；顯著上調(diào)碳酸酐酶(Car)3、Car12的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論:與腰椎髓核組織相比，尾椎髓核組織中的脊索樣細(xì)胞數(shù)目更多，細(xì)胞活性更佳，組織量大，易取材，更適合作為椎間盤(pán)退變研究的種子細(xì)胞。體外單層培養(yǎng)的腰椎與尾椎髓核細(xì)胞表型存在差異。

[關(guān)鍵詞]椎間盤(pán)； 髓核； 表型； 尾椎； 腰椎； 大鼠

大約80%的人一生中至少經(jīng)歷一次下腰痛[1]，隨著人口老齡化的發(fā)展，下腰痛患者的人數(shù)將進(jìn)一步增加，給社會(huì)及個(gè)人帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2- 3]，椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是其主要原因[4]。髓核細(xì)胞外基質(zhì)[5]、脊索樣細(xì)胞(notochordal cells，NCs)[2]的丟失是IDD原因之一。現(xiàn)階段的手術(shù)及保守療法雖緩解疼痛癥狀，但都不能從根本上解決IDD，甚至還能加重相鄰節(jié)段的退變[6]。通過(guò)注射功能性細(xì)胞(促進(jìn)基質(zhì)合成)、分子(刺激內(nèi)源性細(xì)胞合成基質(zhì))或生物材料(減震水凝膠)的生物療法有望修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)IDD[3]。近年來(lái)，細(xì)胞移植療法成為修復(fù)或再生退變椎間盤(pán)組織的研究熱點(diǎn)[7]。大鼠椎間盤(pán)髓核組織中的髓核軟骨樣細(xì)胞(nucleus pulposus cartilage cells，NPCs)及NCs對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)組分的維持有重要作用，被認(rèn)為是理想的種子細(xì)胞[8- 9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離大鼠腰椎髓核組織(lumbar nucleus pulposus，LNP)及尾椎髓核組織(caudal nucleus pulposus，CNP)，觀察髓核組織與細(xì)胞形態(tài)學(xué)及NPCs表型等的差異，為選取合適的椎間盤(pán)移植療法的種子細(xì)胞奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))，胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，青霉素、鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))，Ⅱ型膠原酶(Biosharp，美國(guó))，Annexin Ⅴ- FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基，中國(guó))，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，RNA擴(kuò)增試劑盒(Roche，瑞士)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)、Becton- Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀(Thermo，美國(guó))，ABI Step one plus熒光定量PCR循環(huán)儀、2720 Thermal Cycler普通PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))。

1.2髓核組織分離、稱重及細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及傳代

取5只Sprague- Dawley(SD)大鼠(12周，～200g，東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，過(guò)量水合氯醛腹腔注射處死，酒精消毒背部后切開(kāi)背部皮膚、筋膜與肌肉，游離胸腰椎及尾椎，剖離附著的肌肉與筋膜，放置碘伏中浸泡5min，PBS沖洗后分別于超凈臺(tái)下分離提取3只SD大鼠的LNP與CNP，分析天平稱重，另外2只的腰椎與尾椎椎間盤(pán)浸泡于福爾馬林溶液中備用。另取6只SD大鼠(12周，～200g)，按上述方法分別分離LNP與CNP并放置于0.15%的Ⅱ型膠原酶、37℃搖床中消化3h(每2只大鼠的LNP與CNP為1組)；將含未完全消化組織塊的細(xì)胞懸液經(jīng)1000r·min-15min離心后，直接加完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸后分別種植于3個(gè)T25培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，4d后首次換液，以后每3d換液。原代細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)1∶2傳代培養(yǎng)，以后細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)1∶2傳代培養(yǎng)。

1.3腰椎與尾椎髓核組織HE染色及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取上述浸泡于福爾馬林溶液的椎間盤(pán)組織，蠟塊包埋組織后行HE染色觀察；倒置相差顯微鏡觀察分離培養(yǎng)的原代及傳代后的第2代腰椎髓核細(xì)胞(lumbar nucleus pulposus cells，LNPCs)與尾椎髓核細(xì)胞(caudal nucleus pulposus cells，CNPCs)。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取達(dá)80%融合的第2代LNPCs與CNPCs，消化細(xì)胞后用PBS洗滌2次，2000r·min-1離心5min；500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞后再加入5μl Annexin Ⅴ- FITC并充分混勻；最后加入5μl Propidium lodide充分混勻后移入2.5ml EP管中；錫紙避光包裹并室溫靜置15min，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NPCs表型基因

按照說(shuō)明書(shū)操作提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄后，所得到的cDNA經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)低氧誘導(dǎo)因子(Hif)1α、Hif2α、聚集蛋白聚糖(Acan)、2型膠原(Col2a1)、Brachyury(T)、碳酸酐酶(Car)3、Car12、細(xì)胞角蛋白(Krt)8、Krt18及Krt19基因進(jìn)行擴(kuò)增，以肌動(dòng)蛋白(Act)β為內(nèi)參照。Hif1α引物上游5′- AGCAATTCTC

CAAGCCCTCC- 3′，下游5′- TTCATCAGTGGTGGCAGTTG- 3′；Hif2α引物上游5′- TCACTCATCCTTGCGACCAC- 3′，下游5′- CAGGTGGCCGACTTAAGGTT- 3′；Acan引物上游5′- TGGCCTGCCTGACTTTAGTG- 3′，下游5′- CCTGAACCACTGACGCTGAT- 3′；Col2a1引物上游5′- GGCCAGGATGCCCGAAAATTA- 3′，下游5′- ACCCCTC

TCTCCCTTGTCAC- 3′；Brachyury(T)基因上游5′- GCAAGCTAGAGTCCTTTGCCT- 3′，下游5′- AATCCGCT

GGCTATGGTGTT- 3′；Car3引物上游5′- TGGTTCACTG

GAACCCGAAG- 3′，下游5′- GAGCCTCCTTGCCCTTAG

TC- 3′；Car12引物上游5′- TCCGACAAGGACTGCTTAC

C- 3′，下游5′- GGAGATCCCAAGGACACCAG- 3′；Krt18引物上游5′- ACTACCCGTAAGGTCGTGGA- 3′，下游5′- TTGGTCCCTCAGTCCCCAAG- 3′；Krt19引物上游5′- GTCTTCCTATGGGGGCATGG- 3′，下游5′- TAAAACTTC

CACCGCGTCCT- 3′；Actβ引物上游5′- CCCATCTATGA

GGGTTACGC- 3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTT

C- 3′。以上引物均由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并驗(yàn)證。Krt8引物由查詢以往文獻(xiàn)[10]所得，上游5′- TTGAAACCCG

aGATGGGAAA - 3′，下游5′- GGCCATTCACTTGGACA

TGAT- 3′。PCR反應(yīng)期參數(shù)設(shè)置為95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次并繪制溶解曲線。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Grapd pad prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1髓核組織鮮重比較

LNP(共6個(gè)椎間盤(pán))的總重量為(11.33±1.53)mg，n=3；CNP(共8個(gè)椎間盤(pán))總重量為(45.33±6.51)mg，n=3； 單節(jié)段LNP的平均重量為(1.89±0.25)mg，n=3；單節(jié)段CNP的平均重量為(5.67±0.81)mg，n=3。CNP的總重量及單個(gè)節(jié)段的質(zhì)量均顯著高于LNP(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較

單層培養(yǎng)系統(tǒng)下，LNPCs貼壁時(shí)間為(11.67±1.53)h(n=3)，高于CNPCs的(7.67±0.58)h(n=3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。原代細(xì)胞以集落的形式向外擴(kuò)增生長(zhǎng)，直至不同集落相互融合。然而部分集落相距較遠(yuǎn)，不易相互融合，此時(shí)這些集落中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢。部分細(xì)胞從未消化完全的組織塊中鉆出，越靠近這些未完全消化的組織塊，含液泡結(jié)構(gòu)的NCs越多，反之體形較小呈長(zhǎng)梭形、三角形或多邊形的NPCs和(或)髓核干細(xì)胞越多。LNP與CNP相比，CNP提取的細(xì)胞中NCs較多。原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，LNPCs達(dá)70%融合時(shí)間[(21.67±1.53)d，n=3]多于CNPCs[(16.67±1.53)d，n=3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞達(dá)80%融合速度均明顯降低，含液泡結(jié)構(gòu)的NCs數(shù)量減少，第2代LNPCs中的NCs數(shù)量[(4.67±0.58)，n=3]仍低于CNPCs[(6.33±0.58)，n=3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

*P<0.05

a.LNP與CNP總質(zhì)量； b.單個(gè)節(jié)段LNP與CNP平均質(zhì)量

圖1LNP與CNP鮮重比較

Fig 1Fresh weight comparison between LNP and CNP

a.原代LNPCs； b.第2代LNPCs； c.原代CNPCs； d.第2代CNPCs

圖2LNPCs與CNPCs倒置相差顯微鏡下形態(tài)×100

Fig 2Morphology observation of LNPCs and CNPCs under inverted phase contrast microscopy×100

2.3LNP與CNP HE染色

與LNP相比，CNP含有較多液泡結(jié)構(gòu)的NCs，細(xì)胞外基質(zhì)豐富，而NPCs數(shù)量較少(圖3)。

2.4LNPCs與CNPCs凋亡率比較

第2代LNPCs凋亡率為(6.23±0.29)%(n=3)，稍低于第2代CNPCs的(6.39±0.64)%(n=3)的，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.71>0.05)(圖4)。

2.5NPCs相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示第2代CNPCs與LNPCs相比，CNPCs下調(diào)Hif1α、Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達(dá)，Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的下調(diào)量更明顯；上調(diào)Col2a1、Car3及Car12表達(dá)，且Car3、Car12上調(diào)幅度較大(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

a.LNP； b.CNP

圖3HE染色觀察LNP與CNP形態(tài)×100

Fig 3Morphology observation of LNP and CNP by HE staining×100

a.LNPCs； b.CNPCs

圖4第2代LNPCs與CNPCs細(xì)胞凋亡率

Fig 4Cell apoptosis rate of LNPCs and CNPCs at P2

aP<0.05

圖5CNPCs相對(duì)于LNPCs髓核表型基因的mRNA表達(dá)量

Fig 5Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers of CNPCs rate to LNPCs

3討論

人NPCs形態(tài)在出生前后與胚胎發(fā)育期體形較大、含液泡結(jié)構(gòu)的NCs非常相似[2]，而且這些NCs在10歲左右逐漸死亡和(或)被體形較小的NPCs取代，這也是IDD征象出現(xiàn)的時(shí)期[9- 11]，暗示NCs的死亡和(或)向NPCs轉(zhuǎn)變可能啟動(dòng)IDD。隨著椎間盤(pán)的逐漸成熟，不僅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞所處微環(huán)境及細(xì)胞外基質(zhì)組分也發(fā)生改變，逐漸由嬰兒期髓核組織中高細(xì)胞數(shù)量、低細(xì)胞外基質(zhì)的組分轉(zhuǎn)變?yōu)槌赡旰蟮牡图?xì)胞數(shù)量、高細(xì)胞外基質(zhì)組分[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，原代及傳代后(第1、2代)的CNP中NCs數(shù)量顯著高于LNP，且NCs數(shù)量隨傳代次數(shù)增加而逐漸減少。NCs的死亡和(或)向NPCs轉(zhuǎn)變可能與滲透壓、營(yíng)養(yǎng)、氧含量等微環(huán)境因素有關(guān)，NPCs對(duì)椎間盤(pán)“惡劣”微環(huán)境的耐受性更強(qiáng)[2，13]。然而，這種含液泡結(jié)構(gòu)的NCs的丟失是因細(xì)胞死亡或者轉(zhuǎn)變?yōu)镹PCs仍不清楚[1]。我們研究還發(fā)現(xiàn)，越靠近未完全消化的組織塊，含液泡結(jié)構(gòu)的NCs越多。我們建議，在消化含有NCs的組織時(shí)要控制好消化時(shí)間。充分的組織消化有利于形成單細(xì)胞懸液，而過(guò)長(zhǎng)的消化時(shí)間可能不利于NCs的分離與培養(yǎng)。集落較大時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，這與Turner等[7]的研究一致。在培養(yǎng)這種含有未完全消化組織塊的原代細(xì)胞時(shí)，要根據(jù)集落的大小合理安排傳代時(shí)間，不一定待所有集落完全相互融合時(shí)傳代。

細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡與IDD密切有關(guān)[14]，NCs能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[8]。在軟骨發(fā)育不良狗與非軟骨發(fā)育不良狗(椎間盤(pán)中仍含有NCs)的對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，前者所提取細(xì)胞對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的抑制作用明顯低于后者，其椎間盤(pán)更容易發(fā)生退變[2，15]。軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖，整合素，Ⅱ、Ⅳ型蛋白密切相關(guān)，同時(shí)影響組織的應(yīng)力保護(hù)及滲透壓[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CNP中含液泡結(jié)構(gòu)的NCs數(shù)量明顯高于LNP，細(xì)胞外基質(zhì)豐富，而NPCs數(shù)量較少。NCs的液泡結(jié)構(gòu)參與椎間盤(pán)微環(huán)境的滲透壓調(diào)節(jié)[17]，暗示細(xì)胞外基質(zhì)含量的多少可能與NCs中的液泡結(jié)構(gòu)有關(guān)。我們?cè)O(shè)想，髓核組織所承受的總壓力(p0)、細(xì)胞外基質(zhì)所受壓力(p1)及細(xì)胞所承受的壓力(p2)之間的變量關(guān)系(p0=p1+p2)與NCs液泡結(jié)構(gòu)的丟失有關(guān)。當(dāng)p0不變的前提下，p1的增大(對(duì)應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)增多)會(huì)引起p2的減小，即細(xì)胞承受壓力減小，含液泡結(jié)構(gòu)的NCs數(shù)量相應(yīng)增多，這與我們HE染色結(jié)果相一致，也與軟骨發(fā)育不良狗中NCs較少的現(xiàn)象相符。

位于椎間盤(pán)中心區(qū)域的NCs是脊索動(dòng)物在早期胚胎發(fā)育時(shí)期由脊索發(fā)育形成的[12]。人、牛、羊、馬及軟骨發(fā)育不良狗椎間盤(pán)中的這種含液泡結(jié)構(gòu)的NCs在出生前后就逐漸消失，而在成年的豬、兔、鼠及非軟骨不良狗中仍存在NCs[2]。因此，這些含有NCs的動(dòng)物被認(rèn)為可能不是理想的動(dòng)物模型[18]。然而，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)成年后NCs并未消失，只是形態(tài)上逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镹PCs[17]，且在那些出生前后NCs就逐漸消失的物種(牛、羊、馬)中，直到成年時(shí)IDD的發(fā)生率也無(wú)明顯增加，這種細(xì)胞形態(tài)及大小的轉(zhuǎn)變可能是應(yīng)機(jī)體成熟及功能變化所需的一種選擇效應(yīng)，也有可能是某些物種的特異性發(fā)育[1，14，19]，并不認(rèn)為是退變開(kāi)始的標(biāo)志[17]。這也暗示了在椎間盤(pán)動(dòng)物模型的選擇上，要著重于解剖結(jié)構(gòu)及椎間盤(pán)的力學(xué)特性方面，而不是關(guān)注這些動(dòng)物中有無(wú)NCs方面。我們研究發(fā)現(xiàn)，含較多NCs的第2代CNPCs與LNPCs的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SD大鼠可作為理想的動(dòng)物模型。

細(xì)胞移植療法是修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)IDD的研究熱點(diǎn)[7]。自體NPCs再植術(shù)可有效緩解病人的下腰痛癥狀[3]，延緩IDD進(jìn)程[5]。椎間盤(pán)髓核組織中的細(xì)胞能夠很好地適應(yīng)椎間盤(pán)低氧、高滲、偏酸、營(yíng)養(yǎng)匱乏、周期性力學(xué)負(fù)荷的“惡劣”微環(huán)境[20]，因此自體椎間盤(pán)細(xì)胞被認(rèn)為是細(xì)胞移植療法中最理想的種子細(xì)胞[9]。然而，通過(guò)針刺抽吸正常椎間盤(pán)組織會(huì)誘導(dǎo)加速I(mǎi)DD，且這些正常的椎間盤(pán)組織中細(xì)胞數(shù)量較少，單節(jié)段椎間盤(pán)抽取的細(xì)胞量可能達(dá)不到移植療法的治療量[2]。此外，退變椎間盤(pán)中的細(xì)胞老化率及基質(zhì)降解酶活性較高，基質(zhì)合成能力低下，均達(dá)不到細(xì)胞移植療法的要求[2]。髓核組織中的NCs除了能維持細(xì)胞外基質(zhì)組分外，還能促進(jìn)NPCs及間充質(zhì)干細(xì)胞增殖[8，13]、抑制NPCs凋亡[15]、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡[17]、分泌某些細(xì)胞因子來(lái)修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)IDD[8]，被認(rèn)為是理想的種子細(xì)胞。然而，人NCs在10歲之前就死亡和(或)被NPCs替代，富含NCs的組織只能從更加年輕或胎兒尸體中提取，嚴(yán)重限制富含NCs組織或細(xì)胞移植療法的臨床應(yīng)用[8]。椎間盤(pán)是低血管化的免疫豁免組織，發(fā)生移植物免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較低[4]，暗示著外源性富含NCs組織或細(xì)胞移植到人椎間盤(pán)組織來(lái)修復(fù)IDD有可能成功。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)人多能干細(xì)胞在滅活豬髓核細(xì)胞外基質(zhì)的誘導(dǎo)下可分化為高表達(dá)NCs表型[brachyury(T)、Krt8、Krt18]的細(xì)胞，促進(jìn)Acan及Col2a1的表達(dá)，表明在含有NCs物種的髓核細(xì)胞外基質(zhì)中可能含有與NCs活性、增殖及分化相關(guān)的細(xì)胞因子。在有合適誘導(dǎo)人類(lèi)多功能干細(xì)胞定向分化的生物材料或細(xì)胞因子前提下，有望獲取更多適合椎間盤(pán)生物療法的種子細(xì)胞，從而推動(dòng)生物療法的發(fā)展。

低血管化椎間盤(pán)髓核組織中的氧含量較低，常氧狀態(tài)下的NPCs也高表達(dá)Hif1α及Hif2α，有異于其它軟骨細(xì)胞，被認(rèn)為是NPCs表型[22]。髓核細(xì)胞外基質(zhì)主要由蛋白多糖及膠原蛋白組成，而Acan與Col2a1分別占蛋白多糖及膠原蛋白的比重最大，有異于纖維環(huán)細(xì)胞[23]，被認(rèn)為是NPCs表型[24]。brachyury(T)、Krt8、Krt18、Krt19被認(rèn)為是NCs表型[2，6]。在退變的人[12]及軟骨發(fā)育不良狗[2，15]椎間盤(pán)髓核組織中brachyury(T)低表達(dá)。髓核組織與纖維組織中的細(xì)胞相比，前者高表達(dá)Krt8、Krt18、Krt19[25]，且在人退變椎間盤(pán)髓核組織中表達(dá)下降，也被認(rèn)為是健康NPCs表型[26]。髓核區(qū)域低血管化、糖酵解的特性易化乳糖積聚，Car蛋白與酸堿代謝平衡有關(guān)，對(duì)髓核組織偏酸微環(huán)境的緩沖、NPCs的活性及功能的維持有重要意義[27]，且Car3、12在脊索及出生前后的髓核組織中高表達(dá)，也被認(rèn)為是健康NPCs表型基因[26]。我們對(duì)比研究了LNPCs與CNPCs中上述NPCs表型的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)第2代CNPCs與LNPCs相比，Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。 有意思的是，在液泡結(jié)構(gòu)NCs較多的第2代CNPCs中，NCs表型brachyury(T)、CK- 8、CK- 18/19下調(diào)幅度最大，Acan、Col2a1并未增加，甚至顯著下調(diào)Acan，而與酸堿代謝平衡相關(guān)的Car卻大幅度上調(diào)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)時(shí)間的增加會(huì)下調(diào)NCs表型brachyury(T)、Krt8、Krt18，上調(diào)NPCs Sox- 9、Col2a1表型[6]。成人髓核組織中也表達(dá)brachyury(T)、Krt8、Krt18、Krt19等NCs表型[2]。在持續(xù)壓力作用下的豬椎間盤(pán)組織培養(yǎng)模型中，NCs的丟失與brachyury(T)、Krt8、Acan、Col2a1無(wú)顯著相關(guān)性[17]。在NCs共培養(yǎng)系統(tǒng)中，NCs并不能顯著上調(diào)Acan等NPCs表型的表達(dá)[20]。培養(yǎng)系統(tǒng)、細(xì)胞種系、培養(yǎng)時(shí)間、所選用的支架材料、培養(yǎng)基的不同均能顯著影響細(xì)胞表型[28]。這種表型的差異還可能歸因于以下幾點(diǎn)：(1) 含液泡結(jié)構(gòu)NCs的凋亡[17]；(2) NPCs及髓核干細(xì)胞的增殖[17]；(3) NCs向NPCs或纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化[2]；(4) 髓核干細(xì)胞向NPCs或纖維樣分化[2]。

CNP中細(xì)胞培養(yǎng)效率高[29]、力學(xué)負(fù)荷小[30]、NCs數(shù)量多、組織量大、易取材的特性，可能更有利于IDD的研究。而NCs有維持細(xì)胞外基質(zhì)組分及促細(xì)胞增殖方面的特性，可作為理想的種子細(xì)胞。但不容忽視的是，體外單層常氧條件下培養(yǎng)的LNPCs與CNPCs的表型存在差異，這種表型差異是否有利于抵御氧化應(yīng)激、酸堿代謝平衡等微環(huán)境作用有待進(jìn)一步研究。單層培養(yǎng)系統(tǒng)不能很好地模擬體內(nèi)低氧、高滲、營(yíng)養(yǎng)匱乏、偏酸及周期性力學(xué)負(fù)荷等復(fù)雜多元的微環(huán)境[20]。高糖培養(yǎng)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)NCs自噬相關(guān)基因，經(jīng)線粒體損傷途徑引起細(xì)胞自噬[31]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者更容易遭受脊柱退行性疾病困惱[32]。本實(shí)驗(yàn)選用的是低糖的DMEM/F12培養(yǎng)基，然而糖含量更低的α- 最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimum essential medium)與DMEM/F12培養(yǎng)基相比，前者顯著上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)組分Col2a1、Acan的表達(dá)，可能更適合NCs的培養(yǎng)[13]。NCs與NPCs相比，NCs對(duì)養(yǎng)分[33]、滲透壓[13]要求較高，在體內(nèi)椎間盤(pán)“惡劣”微環(huán)境刺激下，NCs可能難以存活。因此，我們?cè)陉P(guān)注NCs在椎間盤(pán)修復(fù)前景的同時(shí)也要考慮其局限性。

本實(shí)驗(yàn)選用的是體形較小的SD大鼠，其脊柱解剖結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)與人及某些大動(dòng)物相比均有較大差異[34]。細(xì)胞移植療法在犬科動(dòng)物[34]、兔形目動(dòng)物[5，9]及嚙齒目動(dòng)物[9]關(guān)于延緩IDD方面都得到積極的療效。然而，這種積極療效能否應(yīng)用到人身上仍是不容忽視的問(wèn)題。自體細(xì)胞移植療法已經(jīng)開(kāi)展了臨床試驗(yàn)[7]，相信在醫(yī)務(wù)工作者及研究人員的不懈努力下，這些問(wèn)題不日將得以解決，NCs與NPCs移植療法在治療椎間盤(pán)退行性疾病方面將發(fā)揮更大作用。

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cultivation and observation of rat lumbar and caudal vertebra nucleus pulposus tissues and cells and comparative study on nucleus pulposus phenotypic markers

KANG Xin- gui1，WU Xiao- tao2，WANG Feng1，SHI Rui1，CAI Feng1，ZHU Hou- yi1

(1.MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofSpineSurgeryCenter，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective： To isolate， culture and observe nucleus pulposus tissues and cells from the lumbar and caudal intervertebral disc of rat， and to compare the nucleus pulposus phenotypic markers. Methods: The whole spine was separated from 12- week- old Sprague Dawley rats under the sterile condition. The weights of lumbar and caudal nucleus pulposus tissues were measured by analytical balance. Lumbar and caudal nucleus pulposus cells were cultured by adherent cultivation approach. Lumbar and caudal nucleus pulposus tissues morphology and cellular morphologic changes were noted by HE staining and continuous observation under inverted phase contrast approach， respectively. Lumbar and caudal nucleus pulposus cells apoptosis rates were analyzed with flow cytometry. Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers of lumbar and caudal nucleus pulposus cells at P2 were determined by real- time polymerase chain reaction array analysis. Results: The total and single weights of lumbar nucleus pulposus tissues were significantly lower than those of caudal nucleus pulposus tissues(P<0.05). Lumbar and caudal nucleus pulposus cells were isolated and cultured successfully. The adherence time of the primary cells(the cell fusion reached 70%) in lumbar group was significantly longer than that in caudal group in prithany generation(P<0.05). The numbers of notochordal cells in lumbar group were significantly lower than those in caudal group at P2(P<0.05). HE staining showed that the numbers of notochordal cells， the extracellular matrix in caudal group were abandant than those in lumbar group， however， the numbers of nucleus pulposus cartilage cells were lower than those in lumbar group. The cell apoptosis rates had no significant differences between lumbar and caudal nucleus pulposus cells at P2(P>0.05). Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers in caudal group were significant lower expression of Hif2α， aggrecan， Brachyury(T)， Cytokeratin8， 18，19(P<0.05)， and lower expression of Brachyury(T)， Cytokeratin8， 18， and 19 was more steeper， and significant higher expression of Carbonic anhydrase3，12. Conclusion: Compared with the lumbar nucleus pulposus， caudal nucleus pulposus has more notochordal cells， a better cellular status， more tissue， easier assessible， which is more suitable for experiment as a seed cell. Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers have a difference between lumbar and caudal nucleus pulposus cells cultured in monolayer in vitro．

[Key words]intervertebral disc; nucleus pulposus; phenotypic marker; caudal vertebra; lumbar; rats

[收稿日期]2016- 02- 16[修回日期] 2016- 03- 10

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272035，81572170，81572190，81201423)

[作者簡(jiǎn)介]康新桂(1989-)，男，山東青島人，在讀碩士研究生。E- mail:xinguikang@163.com

[通信作者]吳小濤E- mail:wuxiaotao@medmail.com.cn

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1； R- 33； R681.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)03- 0293- 09

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.001

[引文格式] 康新桂,吳小濤,王鋒,等.大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及髓核表型的對(duì)比研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,35(3):293- 301.

·論著·