CYP4A11基因多態性與腦梗死的相關性研究

廖斷修，陳 洪，易興陽，何 妮，王 淳，林 靜

(1.四川省德陽市人民醫院神經內科，四川 德陽 618000；2.溫州醫科大學第三附屬醫院神經內科，浙江 溫州 325200)

CYP4A11基因多態性與腦梗死的相關性研究

廖斷修1，陳 洪1，易興陽1，何 妮1，王 淳1，林 靜2

(1.四川省德陽市人民醫院神經內科，四川 德陽 618000；2.溫州醫科大學第三附屬醫院神經內科，浙江 溫州 325200)

目的 評估CYP4A11基因多態性及其與腦梗死發病及梗死后血管事件的相關性。方法 采用基質輔助激光解吸附電離/飛行時間質譜法(MDLDI-TOF-MS)對396例腦梗死患者及378例對照者的CPYP4 A11rs2269231、CPYP4 A11rs9333025、CYP4F2rs3093135及CYP4F2rs2108622 SNPs進行檢測。并對所有的腦梗死患者隨訪12月。結果 腦梗死組CPYP4 A11rs9333025 GG基因型頻率發布明顯高于對照組(P< 0.001)。CPYP4 A11rs9333025 GG與腦梗死的發病密切相關(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)。rs9333025 GG基因型患者在隨訪期內腦梗死復發率及其他血管事件發生率明顯高于rs9333025 AG基因型患者(P= 0.04)。rs9333025 GG為腦梗死后血管事件發生的獨立危險因素(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)。結論 rs9333025 GG基因型增加了腦梗死的易感性和腦梗死后血管事件發生的風險。

腦卒中；細胞色素P450；基因；變異；CYP4A1l；CYP4F2

腦卒中是一組由血管、環境和遺傳等多因素參與的復雜疾病，是我國人口死亡的首要死因。而腦梗死占所有腦卒中的80%左右，其病因和發病機制均未完全闡明。CYPω-羥化酶可將花生四烯酸(arachidonic acid，AA)轉化為20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE具有較強的血管收縮功能[1]，在自動調節腦血流量和血壓中起重要作用[2]。動物模型研究表明[3]，阻斷20-HETE的合成可減小梗死面積大小。CYPω-羥化酶受CYP4A11和CYP4F2基因的編碼和調控。有研究表明[4，5]，CYP4A11和CYP4F2基因多態性可能影響其酶的活性，與腦梗死發病相關，然而這些研究均為病例對照研究，沒有對患者進行前瞻性隨訪。本研究旨在探討CYP4A11和CYP4F2基因4個位點多態性與腦梗死發病及隨訪期腦梗死復發和其他血管事件發生的相關性，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2010年3月至2013年3月在德陽市人民醫院和溫州醫科大學附屬第三醫院住院首次發病的急性腦梗死患者(腦梗死組)，均符合中華醫學會神經病學分會腦血管病學組制定的診斷標準[6]，均經頭顱MRI證實。采用Han等[7]提出的改良TOAST分型方法對腦梗死進行分型，只納入動脈粥樣硬化血栓型(AT)腦梗死及小動脈病變型(SAD)腦梗死。患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①心源性腦栓死、其他病因型或原因不明確型腦梗死；②既往有腦卒中病史；③腦出血；④伴嚴重心、肝、腎疾病；⑤出院后未正規服用阿司匹林等二級預防藥物；⑥不愿參與該研究；⑦隨訪期有2次上述指標未控制在正常范圍。共納入396例，男235例，女161例，年齡46～85歲[(68.8±11.1)

歲]，AT腦梗死260例，SAD腦梗死136例。對照組為同期無腦卒中病史的門診患者，頭部CT檢查無顱內病變，無腦卒中家族史，彼此之間及與腦梗死組患者之間無血緣關系。共納入378例，男222例，女156例，年齡44～78歲[(65.0±10.3)歲]。

1.2 方法

1.2.1 危險因素的評估 仔細詢問和登記研究對象一般情況，既往病史，個人史及常見危險因素如吸煙、酗酒情況，有無高血壓、糖尿病、冠心病、卒中史等，空腹血檢查血常規、凝血常規、生化常規、血脂全套等。

1.2.2 單核苷酸多態性(SNPs)的檢測 ①研究位點的選擇：參考國外研究位點，此基礎上在NCBI數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)最新登記的各基因人類SNP，登錄人類HapMap計劃數據庫查找標簽SNP(http：//www.hapmap.org/)，設置最小等位基因頻率(MAP)≥0.05，獲得各基因的標簽SNP(TagSNP)，即為本研究各基因研究的位點。據此檢測CYP4A11 rs2269231，rs9333025 和CYP4F2 rs2108622，rs3093135等4個位點的基因型。②檢測方法：抽取腦梗死患者入院第2天及對照組體檢時清晨空腹靜脈血2 ml，用乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝處理，保存于-80 ℃冰箱中備用。采用低滲溶血、酚氯仿法從白細胞中抽提DNA，適量雙蒸水溶解，核酸分析儀測定DNA濃度。通過PCR擴增第1個靶序列，然后加入特異性延伸產物將擴增的片段SNPs連接。PCR引物和單堿基延伸引物都使用Assay Designer軟件包設計，引物序列見表1。SNPs的分型數據獲得是利用PCR的引物延伸和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF；上海生工有限公司)測定[8]。

表1 每個SNP基因型的擴增和延長引物

F：正向引物；R：反向引物

1.3 隨訪和終點指標

1.3.1 隨訪方法 出院后囑患者繼續控制血糖、血脂和血壓，鼓勵患者戒煙戒酒，繼續服用抗血小板藥物。由專人采用電話、信件、門診、家訪等方式對患者進行12個月隨訪。每3個月至少門診隨訪1次，檢查血脂全套、血糖、血壓等。

1.3.2 終點指標 ①復發性缺血性卒中(RIS)，包括新發腦梗死和短暫腦缺血發作(TIA)；②深靜脈血栓形成(DVT)；③心肌梗死(MI)；④全因死亡；⑤出血事件，包括腦出血和顱外出血。對終點事件采用盲法評估，即評估者不知曉DNA分析的結果。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2或Fisher確切概率法。腦梗死發生的危險因素分析采用多因素Logistic回歸；腦梗死患者卒中后12個月發生血管事件風險采用Cox比例風險模型分析。P< 0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 兩組臨床特征比較 與對照組比較，腦梗死組患者年齡偏大，患高血壓、糖尿病的比例較高(P< 0.05)，兩組吸煙、飲酒、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、體重指數(BMI)等比較，差異無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 兩組臨床特征比較

2.2 兩組基因型分布比較 腦梗死組和對照組中4個基因位點的基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P> 0.05)。腦梗死組患者rs9333025 GG基因型頻率分布明顯高于對照者(P< 0.001)，而rs2269231、rs2108622和rs3093135各基因型在兩組中分布差異均無統計學意義(P> 0.05)，見表3。4個位點基因型在AT和SAD患者之間比較差異也無統計學意義(P> 0.05)。多因素Logistic回歸分析表明rs9333025的GG基因型是腦梗死危險因素之一(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)，見表4。

表3 兩組基因型頻率分布比較 [n(%)]

表4 腦梗死發生的Logistic回歸分析

2.3 不同基因型和危險因素的腦梗死患者隨訪期終點指標比較 腦梗死組中4例(1.01%)在隨訪期因外地定居等原因失訪，共392例(98.99%)完成隨訪。隨訪期有54例患者發生新的血管事件(37例RIS，5例死亡，6例MI，6例DVT)。rs9333025 GG基因型腦梗死患者隨訪期總血管事件發生率明顯高于rs9333025 AG基因型腦梗死患者(P= 0.04)，而其他3個位點各基因型與隨訪期血管事件發生差異無統計學意義(P> 0.05)。年齡>68歲，AT型腦梗死，伴高血壓、糖尿病或高LDL的腦梗死患者與隨訪期血管事件發生密切相關 (P< 0.05)，見表5。

表5 首次腦梗死后12月內血管事件發生情況 [n(%)]

2.4 腦梗死患者隨訪期血管事件發生Cox比例風險模型分析 將隨訪期是否發生血管事件作為應變量，將性別、年齡、高血壓、糖尿病、LDL升高、有無吸煙、四個位點的基因型和腦梗死分型等作為自變量進行Cox比例風險模型分析：高血壓病(RR=1.46，95%CI：1.06～3.64，P= 0.018)，糖尿病(RR=1.34，95%CI：1.01～3.02，P= 0.036)和攜帶rs9333025 GG基因型(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)為腦梗死患者隨訪期血管事件發生的獨立危險因素，見表6。

表6 血管事件發生Cox回歸分析

3 討論

本研究主要目的是研究編碼20-HETE合成酶相關基因多態性與腦梗死之間的潛在關聯。結果表明，CYP4A11rs9333025多態性是腦梗死發生的獨立的危險因素，而CYP4A11rs2269231、CYP4F2 rs2108622和rs3093135則與腦梗死無明顯的相關性。這一結果與其他學者研究結果相吻合[9，10]。基于這些研究結果，分析可能原因為CYP4A11 多態性可影響CYP4A11酶的活性，有助于20-HETE的產生，從而導致腦梗死發病風險的增加。

然而本研究結果與某些報道有差異，如Lasker等認為[1]，AA轉化為20-HETE過程中CYP4F2是CYP4A11的10倍，同時顯示抗 CYP4F2治療抑制腎微粒體中20-HETE的形成的效果為抗CYP4A11治療的2倍。Ward等[11]研究表明，是CYP4F2基因而不是CYP4A11基因與20-HETE分泌增加和血壓有關。有研究表明CYP4F2基因多態性與缺血性腦卒中獨立相關[4，11]。然而，本研究結果沒有發現CYP4F2基因多態性與腦梗死的發病相關。造成差異的原因尚不清楚，一個可能的原因是在分子水平有較多因素對腦梗死的發病有關，另一個原因可能是由于種族差異，此外，腦梗死是一組多種危險因素引起的復雜疾病，目前基因多態性與之關系的分析已成為研究熱點[12]，但疾病不僅取決于基因-基因、還取決于基因-環境相互作用的結果[13]，本研究沒有分析基因-基因交互作用對腦梗死發病的影響，這可能也是差異的原因之一。

目前相關基因多態性與腦梗死易感性研究多為病例對照研究，前瞻性隊列研究少。本研究對腦梗死患者進行前瞻性隨訪12個月，發現CYP4A11rs9333025 GG與腦梗死后隨訪期血管事件發生密切相關，Cox 比例風險模型分析表明攜帶 rs9333025 GG基因型的腦梗死患者是腦梗死后血管事件發生的獨立危險因素。

本研究結果提示，CYP4A11多態性不僅與腦梗死易感性相關，而且與腦梗死后血管事件發生密切相關。其機制還不完全清楚。可能CYP4A11基因編碼CYP4A11酶的活性，參與了花生四烯酸代謝為20-HETE。20-HETE在腦血管的調節中發揮著重要作用：它可以促進氧自由基的形成，導致血管內皮功能障礙[14]；可抑制 Na+，K+-ATP酶活性，是腦血管強效收縮因子[15]；激活細胞內的信號傳導通路導致細胞凋亡和細胞死亡[16]。實驗研究已表明，抑制20-HETE的合成減少TIA后的腦梗死面積和改善預后[17]。

本研究尚存較多局限，首先，20-HETE水平沒有測定，不能確定CYP4A11和CYP4F2基因多態性與20-HETE水平之間的相關性；其次，本研究樣本量偏少，僅限于兩個中心研究，因此我們的結果還有待于更大樣本量和多中心研究來證實；第三，較多的CYP通路基因可能與腦梗死發病有關，本研究則主要集中在編碼CYPω-羥化酶相關CYP基因的研究，因此未來的研究應該關注更多的候選基因。

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Correlation between Cytochrome (CYP) 4A11 genetic polymorphisms and cerebral infarction

LIAO Duan-xiu1，CHEN Hong1，YI Xing-yang1，HE Ni1，WANG Chun1，LIN Jing2

(1.Department of Neurology，Deyang People’s Hospital，Deyang 618000，China；2.Department of Neurology，The Third Affiliated Hospital，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325200，China)

YIXing-yang

Objective To evaluate the associations between 4 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the two genes and ischemic stroke as well as atherothrombotic events after stroke.Methods Three hundred and ninety-six patients with ischemic stroke and 378 controls were genotyped for 4 SNPs of the CYP4A11 gene (rs2269231 and rs9333025) and CYP4F2 gene (rs2108622 and rs3093135) using the method of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).All patients were followed up 12-months for atherothrombotic events.Results The frequency of GG genotype of rs9333025 was significantly higher in the ischemic stroke patients than that in controls (P< 0.001).Multiple logistic regression analysis showed that rs9333025 GG was significantly associated with higher risk of ischemic stroke (OR= 1.82，95%CI = 1.24～5.04，P= 0.016).The rs9333025 GG was significantly associated with higher atherothrombotic events than rs9333025 AG during 12 months after stroke (P= 0.04).Multiple Cox regression analysis revealed that the rs9333025 GG was an independent risk factor for atherothrombotic events after adjustment for confounding factors (RR= 1.87，95% CI = 1.16-5.36，P= 0.003).Conclusion rs9333025 GG genotype increases susceptibility to ischemic stroke，and is associated with high frequencies of atherothrombotic events in stroke patients.

Stroke； Cytochrome P450； Genetics； Variants； CYP4 A1l； CYP4F2

R743.33

A

1672-6170(2016)04-0059-05

四川省衛生和計劃生育委員會科研基金資助項目(編號：140025)

易興陽

2015-09-23；

2016-05-23)